Isolering av Funktionell Cardiac immunceller

Summary

Denna metod för att isolera funktionella immunceller från hjärtat ger ett alternativ till konventionella metoder för kollagenas matsmältning, som orsakar oönskade immunceller aktiveras, vilket resulterar i en minskad lyhördhet av dessa celler. Vår metod för isolering ger funktionella hjärt immunceller genom att undvika problem i samband med enzymatisk spjälkning.

Abstract

Hjärtat immunceller vinner intresse för de roller de spelar i den patologiska remodeling i många hjärtsjukdomar ^1-5 Dessa immunceller, som omfattar mastceller, T-celler och makrofager,. Lagra och frigöra en mängd biologiskt aktiva mediatorer, inklusive cytokiner och proteaser som tryptas. ^6-8 Dessa mediatorer har visat sig vara viktiga aktörer i extracellulära matrix ämnesomsättningen genom att aktivera metalloproteinaser eller orsakar kollagen ackumulering genom att modulera hjärt fibroblaster "-funktionen. ^9-11 dock tillgängliga tekniker för att isolera hjärt immunceller har varit problematiskt eftersom de använder bakteriella kollagenas att smälta myocardial vävnad. Denna teknik medför aktivering av immunceller och därmed en förlust av funktion. Till exempel hjärt mastceller blir betydligt mindre känsliga för ämnen som orsakar degranulering. ¹² Därför har vi utvecklat en teknik som gör det möjligt för tHan isolering av funktionella hjärt immunceller som skulle leda till en bättre förståelse för vilken roll dessa celler i hjärtsjukdom. ^{13, 14}

Metoden kräver en förtrogenhet med anatomiska belägenhet råttans xiphoid process, armhålan och falciform ligament och hjärtsäcken i hjärtat. Dessa landmärken är viktigt att öka framgången för förfarandet och att säkerställa en högre avkastning på hjärt immunceller. Dessa isolerade hjärt immunceller kan sedan användas för karakterisering av funktionalitet, fenotyp, mognad, och co-kultur experiment med andra hjärt-celler för att få en bättre förståelse för deras interaktioner.

Protocol

1. Beredning av Hanks Balance Salt Solution (HBSS) Autoklav 1 L glasbägare, tog examen 1000 ml cylinder och rör bar. Rekonstituera HBSS pulvret lösningen i autoklaveras 1 L glasbägare på 900 ml märket med dubbeldestillerat vatten. Blanda HBSS lösning med 3,4 g Hepes Na + salt och justera pH till ett värde mellan 7,35-7,41 med antingen koncentrerad HCl eller NaOH. När det önskade pH-värdet har uppnåtts och förblir stabilt, tillsätt 5 g bovint serumalbumin till lösni…

Discussion

Denna metod för att isolera hjärt immunceller möjliggör analys av deras funktion, fenotyp, och mognad utan oönskade aktivering som normalt sker under en traditionell enzymatisk spjälkning isolering teknik. Det genomsnittliga totala antalet celler erhålls med denna teknik är ca 400 tusen per råtta hjärta och differentierad färgning och flödescytometri analys av dessa celler visar blandad population av T-lymfocyter (~ 70%), makrofager (~ 12%) och mastceller med användningen av denna teknik. (~ 12%). ^{13, …}

Materials

Name of Reagent and Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt	Sigma	H4891	One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic	Gibco	15240-062
HEPES	Sigma	H3784
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3912
250 mL Nalogene Filter Bottle	Thermoscientific	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water

Table of Specific Equipment:

Name of Reagent and Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
3-O Suture Silk Braided	Ethicon Products	SA64H
Small Animal Ventilator	CWE Incorporated	SAR-830	Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle	BD Biosciences	305199	Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter	Baxter	2N111	Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe	Fisher Scientific	14-823-16B
15 mL Falcon Tubes	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-377	Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone	Thermoscientific	S300030.02
Hemocytometer	Hausser Scientific	HS-LB-1483