Dette papir demonstrerer metoder til isolering, oprensning og detektion af exosomes, samt teknikker til analyse af deres molekylære indhold. Disse metoder er tilpasses til exosome isolation fra både cellekulturmedier og biologiske væsker, og kan udover analyse af molekylære indhold også være nyttige i funktionelle studier.
Feltet af exosome forskning er hastigt voksende, med en dramatisk stigning i publikationer i de seneste år. Disse små vesikler (30-100 nm) af endocytic oprindelse blev først foreslået at fungere som en måde for retikulocytter at udrydde transferrin receptor, mens modning til erytrocytter 1, og blev senere opkaldt exosomes. Exosomes er dannet af proceduren for aktiv spirende for sent endosomes, der producerer multivesicular organer (MVBs), og er frigivet i miljøet ved fusion af MVBs med plasmamembranen 2. Siden den første opdagelse af exosomes, har en bred vifte af celler vist sig at frigive disse blærer. Exosomes er også blevet påvist i flere biologiske væsker, herunder plasma-, næse udskylning væske, spyt og modermælk 3-6. Desuden er det blevet påvist, at indholdet og funktion exosomes afhænger af oprindelse celle, og de betingelser, hvorunder de er produceret. En række funktioner er blevet dæmonerkoncentreret for exosomes, såsom induktion af tolerance mod allergenet 7,8, udryddelse af etablerede tumorer hos mus 9, hæmning og aktivering af naturlige dræberceller 10-12, fremme differentiering ind i T regulerende celler 13, stimulering af T-celle proliferation 14 og induktion af T-celle-apoptose 15. År 2007 har vi vist, at exosomes frigives fra mastceller indeholder messenger RNA (mRNA) og microRNA (miRNA), og at RNA kan pendlet fra én celle til en anden via exosomes. I modtagerens celler blev mRNA pendlet ved exosomes vist sig at være oversat til protein, hvilket tyder på en regulerende funktion af de overførte RNA 16. Desuden har vi også vist, at exosomes stammer fra celler dyrket under oxidativt stress kan inducere tolerance mod yderligere stress hos modtageren celler og dermed tyder på en biologisk funktion af exosomal Shuttle RNA-17. Cellekulturmedier og biologiske væsker samarbejdentain en blanding af vesikler og skur fragmenter. En høj kvalitet isolation metode til exosomes, efterfulgt af karakterisering og identifikation af exosomes og deres indhold, er derfor afgørende at skelne exosomes fra andre vesikler og partikler. Her præsenteres en metode til isolering af exosomes fra både cellekulturmedium og kropsvæsker. Denne isolation Metoden er baseret på gentagen centrifugering og filtrering skridt, efterfulgt af en endelig ultracentrifugering trin, hvor de exosomes er pelleteret. Vigtige metoder til at identificere exosomes og karakterisere de exosomal morfologi og proteinindhold er fremhævet, herunder elektronmikroskopi, flowcytometri og Western blot. Rensning af den samlede exosomal RNA er baseret på spin søjlekromatografi og exosomal RNA udbytte og størrelsesfordeling analyseres ved hjælp af en Bioanalyzer.
Når man studerer de molekylære indhold og / eller funktion af exosomes, er det afgørende at bruge en høj kvalitet isoleret metode, der giver et passende afkast og den lavest mulige grad af forurening. Den metode, der beskrives i dette papir er en veletableret metode til at isolere exosomes og undersøge deres RNA indhold og biologiske funktion. Desuden er betydningen af karakterisering af de isolerede exosomes, ved en kombination af forskellige metoder, herunder elektronmikroskopi, flowcytometri, og Western blot, fremhævet.
Når isolere exosomes, er det første centrifugering skridt (300 xg), der anvendes til at pellet celler, der kan være til stede i cellen suspension eller studeret biologisk væske. Den anden centrifugering ved 16 500 xg skal være tilstrækkelig stærk til at pellet døde celler, større vragrester, apoptotiske organer og andre organeller. Efter dette centrifugering, omfatter nogle protokoller en nano-filtrering skridt, men nogle investigators har udelukket dette skridt. Men vi understrege vigtigheden af at udrydde fragmenter og blærer større end 200 nm, og derfor kraftigt anbefale, herunder en filtrering skridt. Hvis en strengere isolation er nødvendig, kan 100 nm filtre bruges, men bemærk at hvis tyktflydende væsker anvendes, kan disse filtre let blive blokeret og exosomal materiale er gået tabt. Desuden kan en 100 nm filtrering påvirker morfologi exosomes og desuden hvis exosomes er på større skala, de kan gå tabt. Således er de 200 nm filtre vil være hensigtsmæssigt for exosome isolation. Efter filtrering, er den obligatoriske ultracentrifugering på 120.000 xg bruges til at pille den exosomes. Den exosomes kan yderligere vaskes med PBS, bundet til antistof coatede perler og vasket, eller placeres på et saccharoseindhold gradient til at fjerne forurening proteiner. Men dette kan være en meget ressourcekrævende proces, som vi argumenterer ikke at være nødvendig, især hvis prøvens volumen er lille og / eller RNA indhold of de exosomes er lav, som ekstra trin i væsentlig grad vil mindske materialet yderligere. Men igen, skal arten af den isolerede vesikler bevises ved tilstedeværelse og fravær af bestemte proteiner.
Til dato har ingen helt unik protein markør for exosomes blevet identificeret til at kontrollere, at prøven indeholder exosomes og intet andet. Som et resultat er en kombination af metoder, der kræves til at karakterisere exosomes, herunder fastsættelse af størrelse og morfologi exosomes ved elektronmikroskopi. Desuden kan renheden af prøven bestemmes ved elektronmikroskopi, som denne metode kan give et overblik over omfanget af forurening af prøven, for eksempel med større blærer, som mikropartikler, apoptotiske organer eller celler vragrester. Desuden kan proteinindholdet i de exosomes bestemmes ved flowcytometri og Western blot, og kombinationen af disse to metoder resulterer i en analyse af både membran bundet (f.eks CD63 ogCD81) og internaliseret proteiner (f.eks Tsg101 og Alix) af exosomes. Påvisning af proteiner beriget med exosomes, som CD63, Tsg101 og Alix, og fraværet af proteiner som det endoplasmatiske reticulum protein calnexin, er en indikation af, at exosome beriget pellet er faktisk exosomes og ikke forurener vesikler fra andre rum i cellen.
Profilen af RNA, som er påvist i exosomes er fundamentalt anderledes end for RNA findes i intakte celler. Således exosomal RNA analyseret af Bioanalyzer eller i gel-baserede RNA analyse tilgange mangler to toppe for 18S og 28S rRNA subunits, som er fremtrædende i analysen af cellulære RNA. Vi har derfor hævde, at påvisning af væsentlige mængder af rRNA i en prøve viser, at den samlede ekstraherede RNA ikke er af exosomal oprindelse alene, og således at den isolation metode skal forbedres og kvalitetssikres.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev finansieret af det svenske Forskningsråd (K2008-57X-20 676-01-3).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Exosome isolation | |||
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 65670 | |
Quick-seal ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | Depending on the rotor used different tubes are needed. Ti70 (342414), Ti45 (345776) | |
Quick-Seal Cordless Tube Topper kit | Beckman Coulter | 358312 | |
Filtropur Syringe Filter, 0.20μm | Sarstedt | 83.1826.001 | For viscose fluids and/or large volumes, a Vacuum filtration system, 0.2 μm, from VWR International can be used instead (514-0600). |
Electron microscopy | |||
Formvar/carbon coated nickel grids | Ted Pella Inc | 1GN200 | |
Mouse-anti-human CD63 | BD Bioscience | 556019 | Final conc: 0.05μg/μl |
Isotype control; IgG1κ (MOPC 21) | Sigma-Aldrich | M9269 | Final conc: 0.05μg/μl |
Anti-Mouse IgG Gold Conjugate, 10 nm | Sigma-Aldrich | G7777 | Final conc: 1% |
LEO 912AB Omega Electron microscope | Carl Zeiss NTS | Or equivalent equipment. | |
Flow cytometry | |||
4μm aldehyd/sulphate latex beads | Interfacial Dynamics | 12-4000 | |
Antibody for coating of the latex beads | For example anti-CD63 from BD Bioscience (556019) | ||
Intelli-Mixer RM-2L | ELMI | Or equivalent equipment. | |
IgG from human serum | Sigma-Aldrich | I4506 | |
Antibodies for detection | BD Bioscience | For example: PE anti-CD63 (556020) PE anti-CD9 (555372) PE anti-CD81 (555676) Isotype control (555749) | |
BD FACSAria | BD Bioscience | ||
Western Blot | |||
Transsonic T 490 DH | ELMA | Or equivalent equipment. | |
Isolation of exosomal RNA and RNA analysis | |||
miRCURY RNA Isolation Kit | Exiqon A/S | 300110 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939A |