מסמך זה מדגים שיטות לטיהור בידוד וזיהוי של exosomes, כמו גם טכניקות לניתוח של התוכן המולקולרי שלהם. שיטות אלה להתאמה עבור בידוד exosome משני תרבות התקשורת התא נוזלים ביולוגיים, והוא יכול מעבר ניתוח של התוכן המולקולרי להיות שימושית גם במחקרים תפקודית.
תחום המחקר exosome הוא המתרחב במהירות, עם גידול דרמטי הפרסומים בשנים האחרונות. בועיות אלו קטנות (3-10 ננומטר) ממוצא endocytic הוצעו הראשון לתפקד כדרך reticulocytes למגר את הקולטן transferrin תוך התבגרות לתוך אריתרוציטים 1, נקראו מאוחר יותר exosomes. Exosomes נוצרות על ידי ניצני פנימה של המנוח endosomes, ייצור גופי multivesicular (MVBs), והן מתפזרות בסביבה על ידי איחוי של MVBs עם קרום הפלזמה 2. מאז הגילוי הראשון של exosomes, מגוון רחב של תאים הוכחו לשחרר אלה שלפוחיות. Exosomes יש גם זוהה נוזלים ביולוגיים, ובהם רוק פלזמה, האף נוזל שטיפה ו חלב 3-6. יתר על כן, הוכח כי התוכן והתפקוד של exosomes תלוי בתא שמקורם ואת התנאים שבהם הם מיוצרים. מגוון פונקציות כבר שדיםtrated עבור exosomes, כגון אינדוקציה של סובלנות נגד 7,8 אלרגן, מיגור של גידולים הוקמה בשנת 9 עכברים, עיכוב והפעלה של תאים הרוצח הטבעי 10-12, קידום התמיינות לתאי T רגולטוריים 13, גירוי של התפשטות תאים T ו – 14 אינדוקציה של תא T אפופטוזיס 15. שנת 2007 הראינו כי exosomes שוחרר מתאי הפיטום מכילים RNA שליח (mRNA) ו microRNA (מירנה), וכי RNA יכול להיות דילג מתא אחד למשנהו באמצעות exosomes. בתוך התאים הנמען, mRNA דילג על ידי exosomes הוצגה להיות מתורגם לחלבון, דבר המצביע על תפקיד הרגולציה של ה-RNA להעביר 16. יתר על כן, אנו הראו גם כי exosomes מתאי צמח תחת סטרס חמצוני יכול לגרום ללחץ נוסף סובלנות נגד בתאים הנמען ובכך להציע הפונקציה הביולוגית של המעבורת exosomal RNA 17. תרבית תאים מדיה ביולוגית שיתוף נוזליםntain תערובת של שלפוחית ולשפוך שברים. באיכות גבוהה בידוד שיטה exosomes, ואחריו אפיון וזיהוי של exosomes ואת התוכן שלהם, לכן חיוני להבחין בין שלפוחית exosomes וחלקיקים אחרים. כאן, אנו מציגים שיטה הבידוד של exosomes ממדיום שני תאים תרבות נוזלי הגוף. שיטה זו מבוססת על בידוד צנטריפוגה חוזרות צעדים סינון, ואחריו צעד ultracentrifugation הסופית שבה exosomes הם pelleted. שיטות חשוב לזהות את exosomes ולאפיין את המורפולוגיה exosomal ואת תכולת החלבון מודגשים, לרבות במיקרוסקופ אלקטרונים, cytometry זרימה כתם המערבי. טיהור של RNA exosomal הכולל מבוסס על כרומטוגרפיה בעמודה ספין התשואה exosomal RNA והפצה גודל מנותח באמצעות Bioanalyzer.
כאשר לומדים את תוכן מולקולרית ו / או פונקציה של exosomes, חשוב להשתמש באיכות גבוהה בידוד שיטה המספק תשואה המתאים את מידת הנמוך ביותר האפשרי של זיהום. המתודולוגיה המתוארת במאמר זה היא גישה מבוססת היטב לבידוד exosomes וללמוד תוכן RNA שלהם פונקציה ביולוגית. יתר על כן, החשיבות של אפיון של exosomes מבודד, על ידי שילוב של שיטות שונות, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים, cytometry זרימה, ואת כתם המערבי, הוא הדגיש.
כאשר בידוד exosomes, צנטריפוגה בשלב הראשון (300 XG) משמש גלולה תאים שעלולים להיות נוכח ההשעיה תא או נוזל ביולוגי למד. צנטריפוגה השני 16 500 XG צריך להיות חזק מספיק כדי גלולה תאים מתים, פסולת גדולים, גופים אפופטוטיים, אברונים אחרים. לאחר צנטריפוגה זה, פרוטוקולים מסוימים כוללים צעד ננו סינון, אבל כמה Investigators יש נשלל על שלב זה. עם זאת, אנו מדגישים את החשיבות של שברי בביעור ועל שלפוחית גדול יותר מאשר 200 ננומטר, ולכן ממליצים כולל בשלב הסינון. אם בידוד מחמירים יותר יש צורך מסננים 100 ננומטר ניתן להשתמש, אבל שים לב כי אם נוזלי צמיג משמשים, מסננים אלה יכולים בקלות להיות חסום חומר exosomal אבוד. כמו כן, סינון 100 ננומטר עשוי להשפיע על המורפולוגיה של exosomes יתר על כן, אם exosomes הם בקנה מידה גדול יותר הם עלולים ללכת לאיבוד. לפיכך, 200 ננומטר מסננים נראה מתאים בידוד exosome. לאחר סינון, ultracentrifugation המנדט ב XG 120,000 משמש גלולה exosomes. Exosomes ניתן לכבס נוסף עם PBS, חייב חרוזים מצופים נוגדן ורחץ, או דגש על צבע סוכרוז להסיר חלבונים זיהום. עם זאת, זה יכול להיות תהליך מאוד משאב רב אנו טוענים כי לא יהיה צורך בכך, במיוחד אם היקף המדגם המוצא היא קטנה ו / או תוכן o-RNAf exosomes הוא נמוך, כמו צעדים נוספים באופן משמעותי להקטין את חומר נוסף. עם זאת, שוב, אופיו של שלפוחית מבודד צריך להיות מוכח על ידי נוכחות והיעדרות של חלבונים מסוימים.
עד כה, סמן לא חלבון ייחודי לחלוטין exosomes זוהתה כדי לוודא כי המדגם מכיל exosomes ולא שום דבר אחר. כתוצאה מכך, שילוב של שיטות נדרשים לאפיין את exosomes, כולל קביעת גודל ומורפולוגיה של exosomes על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים. כמו כן, טוהר המדגם ניתן לקבוע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, כמו שיטה זו יכולה לספק סקירה של רמת הזיהום של המדגם, למשל עם שלפוחיות גדולות יותר, כגון microparticles, גופים אפופטוטיים או פסולת התא. יתר על כן, התוכן של חלבון exosomes ניתן לקבוע על ידי cytometry זרימה כתם המערבי, ואת השילוב של שני אלה התוצאות שיטות ניתוח של הממברנה הן קשורות (למשל, CD63 וCD81) ו הפנימו חלבונים (למשל Tsg101 ואליקס) של exosomes. זיהוי של חלבונים מועשר exosomes, כגון CD63, Tsg101 ואליקס, והעדר של חלבונים, כגון חלבון endoplasmic reticulum calnexin, אינדיקציה כי exosome מועשר גלולה אכן exosomes ולא שלפוחית לזהם מתוך תאים אחרים של התא.
הפרופיל של RNA כי הוא זוהה exosomes הוא שונה במהותו לזה של RNA נמצא בתאים שלמים. לפיכך, RNA exosomal ונותחו על ידי Bioanalyzer או ג'ל מבוססי RNA גישות ניתוח חוסר שתי פסגות של 18S rRNA ו -28 יחידות משנה, אשר הבולטים בניתוח של רנ"א הסלולר. לפיכך, אנו טוענים כי גילוי של כל כמויות משמעותיות של rRNA במדגם מצביעה על כך RNA הכולל חילוץ הוא לא מוצא exosomal לבד, ולכן כי שיטת הבידוד צריך להיות שיפור איכות מובטחת.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי המועצה למחקר השוודי (K2008-57X-20 676-01-3).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Exosome isolation | |||
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 65670 | |
Quick-seal ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | Depending on the rotor used different tubes are needed. Ti70 (342414), Ti45 (345776) | |
Quick-Seal Cordless Tube Topper kit | Beckman Coulter | 358312 | |
Filtropur Syringe Filter, 0.20μm | Sarstedt | 83.1826.001 | For viscose fluids and/or large volumes, a Vacuum filtration system, 0.2 μm, from VWR International can be used instead (514-0600). |
Electron microscopy | |||
Formvar/carbon coated nickel grids | Ted Pella Inc | 1GN200 | |
Mouse-anti-human CD63 | BD Bioscience | 556019 | Final conc: 0.05μg/μl |
Isotype control; IgG1κ (MOPC 21) | Sigma-Aldrich | M9269 | Final conc: 0.05μg/μl |
Anti-Mouse IgG Gold Conjugate, 10 nm | Sigma-Aldrich | G7777 | Final conc: 1% |
LEO 912AB Omega Electron microscope | Carl Zeiss NTS | Or equivalent equipment. | |
Flow cytometry | |||
4μm aldehyd/sulphate latex beads | Interfacial Dynamics | 12-4000 | |
Antibody for coating of the latex beads | For example anti-CD63 from BD Bioscience (556019) | ||
Intelli-Mixer RM-2L | ELMI | Or equivalent equipment. | |
IgG from human serum | Sigma-Aldrich | I4506 | |
Antibodies for detection | BD Bioscience | For example: PE anti-CD63 (556020) PE anti-CD9 (555372) PE anti-CD81 (555676) Isotype control (555749) | |
BD FACSAria | BD Bioscience | ||
Western Blot | |||
Transsonic T 490 DH | ELMA | Or equivalent equipment. | |
Isolation of exosomal RNA and RNA analysis | |||
miRCURY RNA Isolation Kit | Exiqon A/S | 300110 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939A |