Detta papper visar metoder för isolering, rening och detektion av exosomes, samt tekniker för analys av deras molekylära innehåll. Dessa metoder är anpassningsbara för exosome isolerade från både media cellkultur och biologiska vätskor och kan bortom analys av molekylära innehåll också vara användbart i funktionella studier.
Området exosome forskning expanderar snabbt, med en dramatisk ökning av publikationer under de senaste åren. Dessa små blåsor (30-100 nm) av endocytic ursprung var först föreslogs att fungera som ett sätt för retikulocyter att utrota transferrin receptorer medan mogna till erytrocyter 1, och var senare namnet exosomes. Exosomes bildas genom inåt spirande sena endosomes, producera multivesicular organ (MVBs) och släpps ut i miljön genom fusion av MVBs med plasmamembranet 2. Sedan den första upptäckten av exosomes, har ett brett utbud av celler visat att frigöra dessa blåsor. Exosomes har också påvisats i flera biologiska vätskor, inklusive plasma, nässköljvätska, saliv och bröstmjölk 3-6. Dessutom har det visats att innehåll och funktion exosomes beror på ursprung cellen och på vilka villkor de produceras. Ett antal funktioner har demonertrerade för exosomes, såsom induktion av tolerans mot allergen 7,8, utrotning av etablerade tumörer i möss 9, hämning och aktivering av naturliga mördarceller 10-12, främjande av differentiering till T reglerande celler 13, stimulering av T-cell proliferation 14 och induktion av T-cell apoptos 15. År 2007 har vi visat att exosomes frigörs från mastceller innehåller budbärar-RNA (mRNA) och mikro-RNA (miRNA), och att RNA kan skytteltrafik från en cell till en annan via exosomes. I mottagarens celler, var mRNA skytteltrafik genom exosomes visat översätts till protein, vilket tyder på en reglerande funktion av den överförda RNA 16. Dessutom har vi också visat att exosomes härrör från celler som odlas under oxidativ stress kan inducera tolerans mot ytterligare stress i mottagarens celler och därmed antyder en biologisk funktion av exosomal transfer-RNA 17. Cellodling media och biologiska vätskor samarbetentain en blandning av blåsor och skjul fragment. En högkvalitativ isolering metod för exosomes, följt av karakterisering och identifiering av exosomes och deras innehåll, är därför mycket viktigt att skilja exosomes från andra blåsor och partiklar. Här presenterar vi en metod för isolering av exosomes från både cellkulturmedium och kroppsvätskor. Denna isolering Metoden bygger på upprepade centrifugering och steg filtrering, följt av en slutlig ultracentrifugering steg där exosomes är pelleterat. Viktiga metoder för att identifiera exosomes och karakterisera exosomal morfologi och proteinhalt lyfts fram, bland annat elektronmikroskopi, flödescytometri och Western blot. Rening av den totala exosomal RNA är baserad på spin kolonnkromatografi och exosomal RNA avkastning och storleksfördelning analyseras med hjälp av en Bioanalyzer.
När man studerar de molekylära innehåll och / eller funktion exosomes, är det viktigt att använda en hög metod kvalitet isolering som ger en lämplig avkastning och lägsta möjliga graden av kontamination. Den metod som beskrivs i detta dokument är en väletablerad metod för att isolera exosomes och att studera deras RNA-innehåll och biologisk funktion. Vidare är betydelsen av karakterisering av de isolerade exosomes, genom en kombination av olika metoder, inklusive elektronmikroskopi, flödescytometri och Western blot, markerat.
När isolera exosomes, är det första centrifugeringssteget (300 xg) som används för pellets celler som kan finnas i cellen suspension eller de studerade biologisk vätska. Den andra centrifugering vid 16 500 xg måste vara tillräckligt stark för att pellets döda celler, större skräp, apoptotiska organ och andra organeller. Därefter centrifugering, vissa protokoll innehåller en nano-filtrering steg, men vissa investigators har uteslutit detta steg. Dock betonar vi vikten av att utrota fragment och blåsor större än 200 nm, och därför rekommenderar även en filtrering steg. Om en strängare isolering behövs kan 100 nm filter användas, men observera att om viskösa vätskor eller gaser används, kan dessa filter lätt bli blockerad och exosomal material går förlorat. Dessutom kan en 100 nm filtrering påverkar morfologi exosomes och dessutom om exosomes är på större skala de kan gå förlorade. Således 200 nm filter verkar lämplig för exosome isolering. Efter filtrering är obligatoriskt ultracentrifugering vid 120.000 xg används för pellets i exosomes. Den exosomes kan ytterligare tvättas med PBS, bunden till antikropp pärlor och tvättas, eller placeras på ett sackaros lutning för att avlägsna föroreningar proteiner. Detta kan dock vara en mycket resurskrävande process som vi argumenterar inte vara nödvändig, särskilt om det börjar provvolym är liten och / eller RNA-innehåll oF exosomes är låg, som extra åtgärder kommer att avsevärt minska materialet ytterligare. Men, återigen, bör den typ av isolerade blåsor bevisas av närvaro och frånvaro av vissa proteiner.
Hittills har ingen helt unik protein som markör för exosomes identifierats för att verifiera att provet innehåller exosomes och inget annat. Som ett resultat är en kombination av metoder krävs för att karakterisera exosomes, inklusive bestämning av storlek och morfologi av exosomes genom elektronmikroskopi. Dessutom kan renhet av provet bestämmas genom elektronmikroskopi, eftersom denna metod kan ge en överblick av graden av förorening av provet, till exempel med större blåsor, som mikropartiklar, apoptotiska kroppar eller cellrester. Dessutom kan proteinhalten i den exosomes bestämmas med flödescytometri och Western blot, och kombinationen av dessa två metoder resulterar i en analys av både membranbundna (t.ex. CD63 ochCD81) och internaliserad proteiner (t.ex. Tsg101 och Alix) av exosomes. Detektion av proteiner anrikas i exosomes, såsom CD63, Tsg101 och Alix, och avsaknaden av proteiner som endoplasmatiska retiklet proteinet calnexin, är en indikation på att exosome berikade pellets är verkligen exosomes och inte förorena vesiklar från andra fack i cellen.
Profilen av RNA som upptäcks i exosomes är fundamentalt skiljer sig från RNA som finns i intakta celler. Således exosomal RNA analyseras av Bioanalyzer eller i gel-baserad RNA-analys metoder saknar två toppar för 18S och 28S rRNA subenheter, som är dominerande inom analys av cellulärt RNA. Vi hävdar därför att upptäckten av några betydande mängder rRNA i ett prov visar att den totala extraherade RNA inte är av exosomal ursprung ensam, och således att isoleringen metoden behöver förbättras och kvalitetssäkras.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie har finansierats av Svenska Vetenskapsrådet (K2008-57x-20 676-01-3).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Exosome isolation | |||
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 65670 | |
Quick-seal ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | Depending on the rotor used different tubes are needed. Ti70 (342414), Ti45 (345776) | |
Quick-Seal Cordless Tube Topper kit | Beckman Coulter | 358312 | |
Filtropur Syringe Filter, 0.20μm | Sarstedt | 83.1826.001 | For viscose fluids and/or large volumes, a Vacuum filtration system, 0.2 μm, from VWR International can be used instead (514-0600). |
Electron microscopy | |||
Formvar/carbon coated nickel grids | Ted Pella Inc | 1GN200 | |
Mouse-anti-human CD63 | BD Bioscience | 556019 | Final conc: 0.05μg/μl |
Isotype control; IgG1κ (MOPC 21) | Sigma-Aldrich | M9269 | Final conc: 0.05μg/μl |
Anti-Mouse IgG Gold Conjugate, 10 nm | Sigma-Aldrich | G7777 | Final conc: 1% |
LEO 912AB Omega Electron microscope | Carl Zeiss NTS | Or equivalent equipment. | |
Flow cytometry | |||
4μm aldehyd/sulphate latex beads | Interfacial Dynamics | 12-4000 | |
Antibody for coating of the latex beads | For example anti-CD63 from BD Bioscience (556019) | ||
Intelli-Mixer RM-2L | ELMI | Or equivalent equipment. | |
IgG from human serum | Sigma-Aldrich | I4506 | |
Antibodies for detection | BD Bioscience | For example: PE anti-CD63 (556020) PE anti-CD9 (555372) PE anti-CD81 (555676) Isotype control (555749) | |
BD FACSAria | BD Bioscience | ||
Western Blot | |||
Transsonic T 490 DH | ELMA | Or equivalent equipment. | |
Isolation of exosomal RNA and RNA analysis | |||
miRCURY RNA Isolation Kit | Exiqon A/S | 300110 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939A |