Summary
Bir tüp oluşum denemesi tümör hücrelerinin damar etkinliğini değerlendirmek için kullanılır.
Abstract
Geçtiğimiz birkaç on yıl içinde, bir tüp oluşum denemesi büyüme kullanarak faktör-azaltılmış Matrigel genellikle vasküler endotelyal hücrelerin in vitro 1-5 anjiyogenik faaliyet göstermek için istihdam edilmiştir . Ancak, son zamanlarda giderek artan kanıtlar, bu testte, vasküler endotelyal hücreler için davranış test etmek için sınırlı olmadığını göstermiştir. Bunun yerine, aynı zamanda tümör hücrelerinin damar fenotip 6-8 geliştirmek için bir dizi yeteneğini test etmek için kullanılır olmuştur . Bu yeteneği, xenotransplanted hayvanlar, vaskülojenik taklit (VM) 9 olarak bilinen bir süreç olarak tanımlanan vaskülojenik davranışı ile uyumlu idi . Tümör hücre-aracılı VM, endotelyal hücre anjiyogenez 6, 10-13, bağımsız, tümör gelişiminde hayati bir rol oynar gösteren çok sayıda kanıt vardır. Örneğin, tümör hücrelerinin melanoma ve glioblastoma hasta 8, 10, 11 kan, doku örnekleri perfüze, vasküler kanal oluşumu katılmak bulundu . Burada, tümör hücrelerinin vaskülojenik aktivite değerlendirilmesi yararlı bir araç olarak bu borulu şebeke tahlil nitelendirdi. Biz böyle melanom B16F1 hücreleri, glioblastoma U87 hücreleri ve meme kanseri MDA-MB-435 hücre gibi bazı tümör hücre hatları vasküler tübüller formu mümkün olduğunu, ancak bazı kolon kanseri HCT116 hücreleri gibi değil. Ayrıca, bu vasküler fenotip Matrigel kaplanmış hücre sayıları bağlıdır. Bu nedenle, bu testte vasküler potansiyel vasküler hücreler, tümör hücreleri gibi diğer hücrelere de dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri ekrana güçlü bir yardımcı olarak hizmet verebilir.
Protocol
1. Tümör Hücrelerinin vaskülojenik Faaliyet değerlendirin bir Matrigel Tabanlı Tüp Oluşumu Testi
- , Tümör hücreleri ve mikrovasküler endotel hücreleri Hazırlanması: U87 hücreleri, melanom hücrelerinin B16F1, meme kanseri MDA-MB-435 ve kolon hücrelerinin HCT116 gibi beyin tümör hücreleri (% 10 FBS ve penisilin / streptomisin ile desteklenmiş DMEM yetiştirilen tüm Invitrogen gelen .) Endotel hücre hattı insan mikrovasküler endotel hücreleri (HMVECs) 1 mcg / ml hidrokortizon ve 1 ng / ml epidermal büyüme faktörü,% 10 FBS ve penisilin / streptomisin ile desteklenmiş EBM2 orta (Lonza) kültüre edildi. Hücreler PBS üç kez yıkanır ve% 0.05 tripsin / EDTA (Invitrogen) ile müstakil edildi. 2,000 rpm ile 5 dakika süreyle santrifüj sonra, hücre pelletleri tekrar PBS ile yıkandı. Sonra, bir hemasitometre pelet hücreleri sayıldı.
- Matrigel hazırlık: Bir kısım büyüme faktörü-azaltılmış Matrigel (BD Bioscience), oda sıcaklığında ısınmış. Tamamen çözülmüş önce, buz üzerine transfer edildi ve sıvı, en az 10 dakika boyunca buz üzerinde tutulmalıdır. Sonra Matrigel 50 ul Matrigel eşit olarak dağıtmak için izin veren bir yatay düzeyde 96-kuyucuğu kaplama, 37 ° C'de 30 dakika inkübe edildi
- Tüp oluşumu: hücreler (1-2 x 10 4), endotel hücreleri tümör hücrelerinin ya da EBM-2 serum serbest DMEM ile yeniden askıya alınan ve Matrigel üst üzerinde yüklü idi . Bu testte tübül gelişimi üzerine bazı ajanların etkilerini ölçmek için kullanılmış ise, bu ajanlar (uyarıcıları veya inhibitörleri), serum serbest orta eklendi. Her koşullu grup 4-6 kuyu içeriyordu.
- Görüntü ve veri analizi: 37 takiben kuluçka ° C gecede, her iyi, doğrudan mikroskop altında incelendi. Tübüller sabitleme için gerekli olsaydı,% 10 formalin tuzlu tabanlı çözüm ul 100 nazikçe eklendi ve on dakika sonra, analiz için hazır. 10x faz kontrast mikroskop altında, her alanda tübüller görüntülü ve ortalama 3-5 rastgele alanlardan her kuyuda Tübüllerin bir sayılmıştır.
2. Temsilcisi Sonuçlar:
Bu tübüller, poligon ağı oluşturmak bağlanmak uzatılmış hücre gövdeleri üretilmişti HMVECs, pozitif kontrol olarak kullanıldı. B16F1, U87 ve MDA-MB-435 hücre HMVECs tarafından oluşturulan benzer vasküler tübüller geliştirilmiş, ancak HCT116 hücreleri (Şekil 1) vermedi. Doza bağımlı bir hücre tüp oluşumu U87 hücreleri test edildi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, 10.000 hücreleri durdurulan tübüller kurdu. Hücrelerin iki katına sonra, sağlam bir damar ağı HMVECs olarak görülen karşılaştırılabilir. Buna karşılık, 5.000 'den az hücreleri vasküler bir fenotip oluşturmak için başarısız oldu.
Şekil 1 Tüp oluşumu HMVECs, U87, MDA-MB-435, ve B16F1 hücreleri tarafından uyarılan, ancak HCT116 hücreler, tüm hücrelerin (2 x 10 4) Matrigel üzerinde yüklü olan ve gece boyunca inkübe edildi . Tübüller faz kontrast kullanılarak görüntülenmiştir. HMVECs Pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. 3-5 alanların bir temsilci gösterildi. Bar: 100 mikron.
Şekil 2 hücre sayısı bağımlı bir şekilde hücre kaynaklı U87 tübüller Farklı sayıda köşeleri belirtildiği gibi U87 hücrelerinin tüp oluşumu için kullanılmıştır. HMVECs pozitif kontrol için kullanılmıştır. Bar: 100 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu testte başarılı olmak için, Matrigel kalitesini ilk test edilmelidir. Bioscience BD HMVECs kullanarak tahlil öncesi çalıştırmak için küçük bir örnek alınabilir. Farklı parti ürünleri, bazı çok sayıda tüp oluşumu için en uygun durumda vermezseniz hangi benzemeyen nitelikler gösterebilir. Matrigel bir kısım 96-kuyucuğu yüklendiğinde kabarcıkları tübül oluşumu bozabilir çünkü İkincisi, herhangi bir kabarcıkları kaçınılmalıdır olmalıdır. Minik kabarcıklar iyi tespit edilirse, Matrigel hemen deney sırasında buz üzerinde tutulmalıdır orijinal Matrigel tüpleri geri döndü olabilir. Buna ek olarak, test edilen hücrelerde bir günlük aşamada bir büyüme oranı muhafaza edilmelidir. Hücrelerin yavaş büyüme gösteren herhangi bir kültür koşulları oluştuğunda, sağlıklı hücreleri ile değiştirilmesi gerekir. Azalma sıcaklığı (oda sıcaklığı) tüp oluşumunu etkileyebilir çünkü tüpler sabit değildir Son olarak, eğer bir mikroskop altında tüp analizi, bir saatten daha uzun olmamalıdır. Bütün tahlil, hücre ölümüne yol açtığı tübüler yapısı kesintileri önlemek için 24 saat içerisinde tamamlanması gerekmektedir. Biliyorsunuz tüp oluşumu, hücre göçü, hücre-hücre adezyon, hayatta kalma ve apoptosis de dahil olmak üzere birçok hücresel aktive süreçleri ile karakterize olduğu bilinmektedir. Örneğin, hücre göçü ve hücre-hücre adezyon tüp gelişimi sırasında fark edilir. Durdurulan ağ giderek görüldüğü gibi 24 saat sonra, ancak, önemli hücre apoptozis gerçekleşir. Bu olay hem endotel hücre ve tümör hücre kaynaklı tüp oluşumu meydana gelir.
Bu testi, in vitro endotelyal hücre ile ilişkili anjiyogenez bağımsız olay tümör hücresi vaskülojenik faaliyet değerlendirilmesi için kritik olduğu ortaya çıkmaktadır . Burada, biz göstermiştir Matrigel insan hem de hayvan modellerinde 14-17 tümörlerin bu tür vaskülojenik bir davranış ile tutarlı melanom hücre hattı B16F1 ve meme kanseri hattı MDA-MB-435 geliştirilen damar ağları, . Mekanistik Matrigel HCT116 hücreleri vasküler bir fenotipi geliştirmek için başarısızlık olarak bilinmemekle birlikte, bu vasküler özelliği, tümör hücre tipi bağımlı olabileceğini de iddia. HCT116 hücreleri B16F1 ve MDA-MB-435 hücre ile karşılaştırıldığında, in vivo olarak VM oluşturmak için yeteneğinden yoksun olmadığını bilmek ilginç olurdu. Bu nedenle, bu testte kurulması kanser biyolojisi, vasküler biyoloji yanı sıra uyuşturucu tarama çalışmasında büyük önem taşımaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NCI R01 CA120659 (SC) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Biosciences | 47743-720 | |
| EBM2 kit | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| Nikon ECLIPSE TS100 microscope | Nikon Instruments |
References
- Shao, R., Guo, X. Human microvascular endothelial cells immortalized with human telomerase catalytic protein: a model for the study of in vitro angiogenesis. Biochemical & Biophysical Research Communications. 321, 788-794 (2004).
- Ribeiro, M. J. Hemostatic properties of the SV-40 transfected human microvascular endothelial cell line (HMEC-1). A representative in vitro model for microvascular endothelium. Thromb Res. 79, 153-1561 (1995).
- Ades, E. W. HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. J Invest Dermatol. 99, 683-690 (1992).
- Shao, R. Acquired expression of periostin by human breast cancers promotes tumor angiogenesis through up-regulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression. Molecular & Cellular Biology. 24, 3992-4003 (2004).
- Shao, R. YKL-40, a secreted glycoprotein, promotes tumor angiogenesis. Oncogene. 28, 4456-4468 (2009).
- Basu, G. D. A novel role for cyclooxygenase-2 in regulating vascular channel formation by human breast cancer cells. Breast Cancer Research. 8, R69-R69 (2006).
- Scavelli, C. Vasculogenic mimicry by bone marrow macrophages in patients with multiple myeloma. Oncogene. 27, 663-674 (2008).
- El Hallani, S. A new alternative mechanism in glioblastoma vascularization: tubular vasculogenic mimicry. Brain. 133, 973-982 (2010).
- Maniotis, A. J. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry. American Journal of Pathology. 155, 739-752 (1999).
- Hendrix, M. J., Seftor, E. A., Hess, A. R., Seftor, R. E. Vasculogenic mimicry and tumour-cell plasticity: lessons from melanoma. Nature Reviews Cancer. 3, 411-421 (2003).
- Folberg, R. Tumor cell plasticity in uveal melanoma: microenvironment directed dampening of the invasive and metastatic genotype and phenotype accompanies the generation of vasculogenic mimicry patterns. American Journal of Pathology. 169, 1376-1389 (2006).
- Liu, C. Prostate-specific membrane antigen directed selective thrombotic infarction of tumors. Cancer Research. 62, 5470-5475 (2002).
- Sood, A. K. The clinical significance of tumor cell-lined vasculature in ovarian carcinoma: implications for anti-vasculogenic therapy. Cancer Biology & Therapy. 1, 661-664 (2002).
- Shirakawa, K. Hemodynamics in vasculogenic mimicry and angiogenesis of inflammatory breast cancer xenograft. Cancer Research. 62, 560-566 (2002).
- Ruf, W. Differential role of tissue factor pathway inhibitors 1 and 2 in melanoma vasculogenic mimicry. Cancer Research. 63, 5381-5389 (2003).
- Seftor, R. E. Cooperative interactions of laminin 5 gamma2 chain, matrix metalloproteinase-2, and membrane type-1-matrix/metalloproteinase are required for mimicry of embryonic vasculogenesis by aggressive melanoma. Cancer Research. 61, 6322-6327 (2001).
- Shirakawa, K. Vasculogenic mimicry and pseudo-comedo formation in breast cancer. International Journal of Cancer. 99, 821-828 (2002).
