Biochemische Rekonstitution der Steroid-Rezeptor • Hsp90-Protein-Komplexen und Reaktivierung der Ligandenbindung
Summary
Ein<em> In-vitro-</em> Verfahren zur Herstellung von funktionellen Glucocorticoid-Rezeptor (GR) • hsp90-Protein-Komplexe aus gereinigten Proteinen und zellulären Lysaten beschrieben. Das Verfahren nutzt Immunadsorption von rekombinantem GR durch Salz-Strippen und Protein-Komplex Rekonstitution gefolgt. Die Bedeutung von Kofaktoren und Puffer-Bedingungen diskutiert werden, wie potenzielle Methode geeignet sind.
Abstract
Hsp90 ist ein wesentlicher und sehr reichlich molekularen Chaperon-Protein, das gefunden wurde, mehr als 150 eukaryotischen Signalproteine, einschließlich Transkriptionsfaktoren (zB nukleare Rezeptoren, p53) und Proteinkinasen (zB Src, Raf, Akt-Kinase) in Zellzyklus beteiligt zu regeln, Tumorgenese, der Apoptose, und mehrere eukaryotischen Signalwege 1,2. Von diesen vielen "Kunden" Proteine für hsp90, die Montage von Steroid-Rezeptor • hsp90-Komplexen ist die beste definiert (Abb. 1). Wir stellen Ihnen hier eine anpassungsfähige Glucocorticoid-Rezeptor (GR) Immunpräzipitationsassay und in vitro GR • hsp90 Rekonstitution Methode, die ohne weiteres eingesetzt werden kann, um eukaryotische hsp90 funktionelle Aktivität, hsp90-vermittelte Steroid-Rezeptor-Liganden-Bindung und der molekularen Chaperon-Cofaktor Anforderungen Sonde. Zum Beispiel kann dieses Tests verwendet werden, um hsp90 Cofaktor Anforderungen und die Auswirkungen der Zugabe von exogenen Verbindungen zur Rekonstitution Verfahren zu testen.
Der GR hat ein besonders nützliches System für das Studium hsp90 worden, weil der Rezeptor hsp90 gebunden sein muss, um eine offene Ligandenbindung Spalt, auf den Steroid-3 ist zu haben. Endogene, unliganded GR ist im Zytoplasma von Säugerzellen kovalent an hsp90 gebunden. Wie in den endogenen GR • hsp90 Heterokomplex gefunden, wird der GR-Liganden Bindungsschlucht öffnen und binden Steroid. Wenn hsp90 distanziert sich von der GR oder wenn seine Funktion ist gehemmt, ist der Rezeptor nicht binden Steroid und die Rekonstitution des GR • hsp90 Heterokomplex vor steroid-bindenden Aktivität ist 4 restauriert. GR aus Zellcytosol mit einem monoklonalen Antikörper immunpräzipitiert, und Proteine, wie zB hsp90 im Komplex mit dem GR mittels Western Blot getestet werden kann. Steroid Bindungsaktivität des immunpräzipitiert GR kann durch Inkubation der immunopellet mit [3 H] Steroid bestimmt werden.
Frühere Experimente haben hsp90-vermittelte Öffnung der GR Ligandenbindung Spalt gezeigt, erfordert hsp70, ein zweiter molekularer Chaperone auch wichtig für eukaryontische Lebensfähigkeit der Zellen. Biochemische Aktivität von hsp90 und hsp70 werden durch Co-Chaperon-Proteinen Hop, Hsp40 und p23 5 katalysiert. Ein Multiprotein Chaperon Maschinen mit hsp90, hsp70, Hop und Hsp40 sind endogen in eukaryotischen Zelle Zytoplasma vorhanden ist, und Retikulozytenlysat bietet ein Chaperon-reiches Protein Quelle 6.
In dem vorgestellten Verfahren ist GR aus Zellcytosol immunoadsorbed und gestrippt des endogenen hsp90/hsp70 Chaperon Maschinen mit einer milden Salz Bedingungen. Das Salz-abgestreift GR wird dann mit Retikulozytenlysat, ATP und K +, die in die Wiederherstellung der GR Ergebnisse inkubiert • hsp90 Heterokomplex und Reaktivierung von Steroid-bindenden Aktivität 7. Diese Methode kann genutzt werden, um die Auswirkungen der verschiedenen Chaperon-Cofaktoren, neuartige Proteine und experimentelle hsp90 oder GR-Inhibitoren zu testen, um ihre funktionelle Bedeutung auf hsp90-vermittelte Steroid verbindlich 8-11 zu bestimmen.
Protocol
Discussion
Die oben beschriebenen Test lässt sich an einer Vielzahl von Erkrankungen des Chaperon Aktionen der hsp90/hsp70-based Chaperon Maschinen sowie GR Steroid verbindlich zu testen. Es ist eine Abwandlung der zuvor beschriebenen Verfahren 4,8,9,17 und ist so konzipiert, um die Vorteile der jüngsten Fortschritte in der Elektrophorese-Technik zu nehmen und werden von einem breiteren Forschungsgemeinschaft. Weitere Cofaktoren oder Proteine von Interesse kann der GR hinzugefügt werden • hsp90 Heterokomplex …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewähren GM086822, Hope Heart Institute Basic Sciences ausgezeichnet, und die MJ Murdock Charitable Trust Hochschule Science Research-Programm finanziert. Wählen Elektrophorese Reagenzien und Bildanalyse-Software wurden großzügigerweise von Bio-Rad zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Applied Science | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce/Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer | NET1192001MC | follow safety precautions |
References
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M. Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention. Leukemia. 19, 710-712 (2005).
- Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts. J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).
- Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. Reconstitution of the steroid receptor•hsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).
- Morishima, Y. The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system. J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).
- Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).
- Dittmar, K. D., Pratt, W. B. Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation. J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).
- Kanelakis, K. C. Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery. J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).
- Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes. Biochimie. 40, 1109-1116 (2001).
- Murphy, P. J. M. Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation. J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. Stepwise assembly of a glucocorticoid receptor•hsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket. J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).
- Bodwell, J. E. Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).
- Penna, A., Cahalan, M. W. e. s. t. e. r. n. Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).
- Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR). Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).
- Cintron, N. S., Toft, D. Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway. J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).
