1. Craniectomy En steril operationsområdet är beredd med en stereotaxic anpassning instrument (Kopf Instrument) för möss med en mus gas anestesi huvudet hållare (Kopf Instruments) är ansluten till en anestesiapparaten med O 2 flush (Parkland Scientific) för att möjliggöra kontinuerlig inandning av isofluran under operation . En uppvärmning pad förvaras vid 37 ° C är placerad under musen under operation. En kirurgisk mikroskop och ljuskälla behövs. Försöksledaren ska bära en labbrock, kirurgisk mask, fot täcker, handskar och huvudbonad. Alla verktyg och material som kontaktar operationsområdet bör steriliseras. En skada nav, som består av kvinnliga slutet av en Luer-lok, skapas genom att skära bort metall slutet av en 20 g 1 ½ "nål (Becton Dickinson) med ett rakblad. Navet ska klippas med en liten bias och har en ca 3 mm innerdiameter öppning. trephine (se steg 1,10) kan användas för att mäta och tillverka en skada navet i rätt diameter. Ett nav krävs per djur. Navet kommer att knytas till skallen och ansluten till LFP anordning för att leverera pulsen på trycket. Fast nylonlina (1,7 mm i diameter, t.ex. sjögräs trimmerlina) klipps i ~ 1 mm tjock diskar med ett rakblad. Återigen är en skiva krävs per djur. Detta används för att stabilisera trephine samtidigt utför craniectomy (se steg 1,10). Möss kan vara av vilken stam och ålder (vi huvudsakligen använder C57BL / 6 åldrarna 1 – 9 månader). Musen vägs och bedövas i en liten induktion kammare (förfyllda med 4-5% isofluran i 100% O 2) i minst 1 minut. För förebyggande smärtlindring, är en injektion av buprenorphrine (0,1 mg / kg) givet intraperitonealt och musen placeras tillbaka in i kammaren för en annan minut. Smärtstillande behandlingen skall bekräftas genom samråd med lokala djur-användning och vård kommitté. Håret på toppen av musen huvud är klippta så nära huden som möjligt. Musen är placerad i ett stereotaxic anpassning instrument utrustade med lagom klädd för att administrera flyktig gas anestesi (Kopf instrument). Nivån på isofluran gasen reduceras till 2% eller att genomföra. Andning övervakas visuellt under operationen. Andra fysiologiska parametrar såsom blodgaser (p O 2, p CO 2), blod pH eller blodtryck kan mätas med lämplig utrustning under förfarandet. Artificiella tårar smörjmedel ögonsalva läggs på ögonen på musen med hjälp av en bomullstuss applikator för att hålla dem från uttorkning. Povidon-jod appliceras på huden mellan ögonen och hals med en bomullstuss applikator följt av 70% alkohol. Tillämpningen av povidon-jod och alkohol upprepas för totalt 3 gånger. En mittlinjen hårbotten snitt görs från ögonen till nacken med hjälp av en skalpell (# 15 blad) och huden indragen med en liten bulldog klämmor (Fine Science Tools # 18.050-28) att avslöja skallen och ger en tydlig kirurgiska området. The Bulldog klämmor hänga utanför sidokanter skallen. Bedövningssalva bupivakain (0,025% i koksaltlösning) appliceras på skallen med en bomullstuss applikator och fascia är skrapas från skallen med spetsen av dentala verktyg eller ben skrapa (t.ex. Fine Science Tools, # 10.075-16). En permanent markör används för att markera skallen halvvägs mellan bregma och lambda och mellan sagittal suturen och laterala kanten över den högra hjärnhalvan (~ 2 mm höger om mittlinjen). En droppe Loctite cyanoakrylat lim (Loctite Tak Pak 454) läggs i en plast väger båt och sida griptänger (Fine Science Tools, Dumont # 6) används för att doppa en skiva av ogräs fast nylonlina (se 1.3 ovan) i lim och tryck sedan på skivan på märket på skallen. En till två droppar av Loctite Accelerator levereras ovanpå hårddisken med en 1 ml spruta och 26 3 / 8 g nål för att orsaka härdning av lim. Testa anslutning av skivan till skallen innan du fortsätter. Placera en 3 mm ytterdiameter trephine (Forskning Instrumentering Shop, University of Pennsylvania) över disken och snurra medurs tills du har klippt igenom skallen. Kontrollera trephine framsteg ofta för att undvika att borra för långt in i skallen och att bryta mot dura. Det kommer att bli en gallring av skallen i ytterkanten av skivan och skalle luckan kommer att kännas lös när man trycker lätt på. Placera dentala verktyg parallellt / horisontellt till skallen yta för att bända i skallen och lyfta benet luckan upp. Lossa ben från skallen med pincett. Om det finns en liten blödning, utan kompromisser av duran, använd en bomullstuss applikator att utöva påtryckningar tills blödningen upphör och förhindra ben damm från att komma in på dura. Men om det finns ett hål i duran så att diskbråck är synlig, ska djuret tas bort från experimentet med humana dödshjälp. Detta steg kräver tillräcklig erfarenhetatt uppnå den kirurgiska kompetens som krävs. Använd pincett, underhålla skadan navet i position över craniectomy i skallen så att partiskhet av navet är i linje med krökning av skallen (dvs. längre kanten på navet ligger nära den laterala kanten av skallen). Under tiden med hjälp av en träpinne, skär i en vinkel med ett rakblad att ha en vass spets, applicera superlim gelé runt ytterkanterna av navet med den andra handen och stabilisera navet tills det sitter upprätt över hålet. Man måste vara försiktig att inte få lim på toppen av dura. Limma på dura kommer att orsaka en dämpning av skadan. Använd en liten papper kopp, blanda metyl-metakrylat dentala akryl (Jet akryl vätska med Perm reline / Reparation Resin, Butler Schein) för att skapa en viskös lösning. Använd en 1 cc spruta utan nål fäst gäller cement runt skadan nav. Den cement bör täcka botten 2 mm av skadan navet samt den omgivande exponerade skallen. Skallen suturer tätas med cement för att se till att vätskan bolus från den skada som håller sig inom hjärnskålen. Fyll navet med steril 0,9% NaCl (koksalt) med hjälp av en spruta och trubbiga nålen. Den saltlösning kommer att hålla duran fuktig under återhämtningsfasen. Dessutom, om skadan navet inte stannar fyllda, kommer att tyda på en läcka i navet anslutning till skallen och ett nytt nav bör bifogas. Musen bör ges en 0,25 ml injektion av steril koksaltlösning IP, bort från stereotaxic anpassning instrumentet och placeras i en tom bur med ingen tråd bar lock på en värmeplatta. Placera några hydragel på botten av buren och låt möss att återhämta sig i 1-2 timmar. 2. Induktion av skada Sätt på oscilloskopet (Tektronix TDS 1001B, två kanaler Digi minnesoscilloskop 40 MHz, 500Ms.s) och förstärkare (Trauma inducer tryckgivare förstärkare) som är ansluten till LFP-enheten. Kontrollera att LFP-enheten (Egen design och tillverkning, Virginia Commonwealth University) och högt tryck slang (längd 41cm, volym 2 ml, Baxter # 2C5643) som är anslutna till det fylls med sterilt vatten och fri från luftbubblor. I slutet av slangen är en manlig Luer-Lok bit. Med Luer-lok änden av slangen stängd leverera testpulser genom att släppa pendeln. Enheten skall förberedas genom att leverera cirka 10 testpulser. Kontrollera att pendeln ger jämn signal på oscilloskopet och förstärkare. En högljudd signal indikerar luft i systemet som måste bort innan leverera skadan puls. Längden på pulsen ska vara ca 20 msek. Givaren förstärkare medföljer LFP enheten är kalibrerad så att 10 mV = 1,0 pounds per kvadrattum (PSI). En atmosfär (ATM) = 14,7 PSI. Skada levererade trycket är normalt i intervallet 0,9 till 2,1 atmosfärer för att producera en rad rätande reflex gånger och en ökad dödlighet i samband med lungödem. Mild skada anses vara en rätande reflex tid av 2 – 4 min och 0 – 5% dödlighet. Måttliga skador anses vara en rätande reflex på 6 – 10 min och en 10 – 20% dödlighet. Om nödvändigt, justera vinkeln på pendeln att öka eller minska intensiteten i puls. Vinkeln på pendelns startposition är cirka 10 grader. Efter justering av LFP-enheten, se till att öppna Luer-Lok änden av slangen. Musen placeras i 4-5% isoflurananestesi kammare (förladdas) tills en kirurgisk plan av anestesi nås. Musen placeras på en plattform bredvid LFP enheten och navet är fylld med steril koksaltlösning. Slangen av LFP enheten med en manlig Luer-lok är knuten till den kvinnliga luer-lok montering av navet. Djuret har placerats på sin sida och när en normal andning igen mönstret, men innan djuret återfå hela medvetandet (~ 2 min), är pendeln av LFP apparaten släpps för att orsaka en enstaka puls av skada. Det är viktigt att inte framkalla skada medan djuret är för bedövas eftersom det kan leda till andningssvikt och död. Den exakta tryck pulsen bör registreras. Oskadd, bluff djur genomgår alla på samma sätt med undantag av själva vätskan pulsen att framkalla skada. Djuret bör omedelbart avlägsnas från LFP enheten och placeras på rygg för att övervaka rätande reflex tiden. Efter att musen har rättas till sig själv, är det sedan snabbt sövda igen och cement och navet bort tillsammans från skallen för hand. Hårbotten är då stängd med Vetbond vävnad lim (3M), suturer eller häftklamrar. Alla diskbråck av dura eller ocklusion av navet noteras. En ockluderade nav kommer att producera en försvagad skador av okänd omfattning. Djuret placeras tillbaka i buren på en uppvärmning pad till öppenvård och återvände sedan till sitt hem bur. 3. Bedömning av motoriska, kognitiva och histologiska resultat Den moTor underskott orsakade av LFP kan bestämmas med hjälp av rotarod test, en indikator på integrerad vestibulomotor och sensomotoriska funktion 21. Alla djur måste testas innan de skada att fastställa en baslinje läsning och att vänja mössen till paradigm. Möss är utbildade på rotarod enhet 3 gånger per dag med 1-timmes intertrial mellanrum under de två dagar före skadan. Latensen att balansera på en 36-mm ytterdiameter, roterande staven, som har en gummiyta mäts. Hastigheten ökar från 4 till 40 rpm under en 180 sek intervall. Varje försök slutar när djuret faller av rotarod. Vid olika tidpunkter efter skada (vanligtvis 1, 7 och 21 dagar), är de möss åter testats på rotarod enhet. Utvärdering av rotarod test efter skadan baseras på den individuella poäng i förhållande till det ursprungliga latenser 22. Den genomsnittliga latens falla av skadade möss jämfört med de falska möss. Kognitiv funktion efter LFP kan testas på en separat uppsättning av möss med Morris Water Maze (MWM), ett känsligt mått på posttraumatiskt spatiala inlärning och arbetsminne hos gnagare 23. Möss är acklimatiserade till paradigm och testade för baslinjen svar med hjälp av en synlig plattform testa 4 dagar före skada. En vit rund pool (1 m diameter) är fylld med vatten och giftfri vit färg. Plattformen är synlig med hjälp av en flagga eller markör och inga visuella referenser finns på väggarna. Över 4 studier är musen placeras i kvadrant motsatta som det synliga plattformen och latens för att hitta den plattformen mäts. Maximal försökstiden är 60 sek och musen kvar eller placeras på plattformen i 15 sekunder i slutet av varje prövning. Den intertrial intervallet är 5 minuter under vilken musen värms på en värmedyna. Plattformen flyttas till en annan kvadrant för varje rättegång och fyra försök utförs. För att bedöma lärande, möss utbildade på MWM med hjälp av en dold plattform fast i en av fyra kvadranter vid olika tidpunkter efter skada (vanligtvis 1, 7 och 21 dagar). Svart och vitt signaler är placerade på väggarna. Den kvadranten där musen är placerad är pseudorandomly varierat under utbildning och tid att hitta plattformen är inspelad. Maximal försökstiden är 60 sek och musen kvar eller placeras på plattformen i 15 sekunder och värmas i 5 min mellan försöken. Möss utsätts för 8 prövningar / dag i 3 dagar i följd. För att bedöma minne lagring, är de djur som utsätts för en 60 sek sond rättegång dagen efter den sista träningen. Under sonden rättegången, är plattformen bort för att bestämma tid och avstånd simmat i kvadranten där plattformen brukade vara. Slutligen är en synlig plattform för test gjort för att utesluta eventuella motoriska och visuella underskott som utvecklats efter skada. För att bestämma histologiska konsekvenserna av LFP skada är vävnad fastställs av intrakadriell perfusion i 0,9% NaCl följt av 4% paraformaldehyd vid önskad tidpunkt poäng efter skada. Tissue är postfixed över natten vid 4 ° C och sedan cryoprotected i 10% och 30% sackaros och bädda lösning. Frysta seriell sektioner klipps på ett kryostat och bearbetas med hjälp av olika immuohistochemical och histologiska tekniker. 4. Representativa resultat: Skadan orsakas av LFP-enheten är reproducerbart från djur till djur, särskilt med tillräcklig kirurgisk utbildning. För att behålla konsekvensen av skadan, är det tryck som levereras till dura av enheten övervakas. Pendeln slår en vattenfylld akryl cylinder med högt tryck slang och luer-lok montering som är ansluten till den skada navet anbringas på craniectomy webbplatsen på djuret (Figur 1A). För en mild till måttlig skada, är vinkeln på pendeln inställd på att skapa ett tryck på mellan 0,9 till 2,1 atm och ett oscilloskop kopplas till en förstärkare används för att visualisera trycket puls (Figur 1B). Skada producerar många typer av rätande reflex gånger och en ökad dödlighet i samband med lungödem. Mild skada anses vara en rätande reflex tid av 2 – 4 min och 0 – 5% dödlighet. Måttliga skador anses vara en rätande reflex på 6 – 10 min och en 10 – 20% dödlighet. Dessutom kan möss utsätts för LFP uppvisar tonic poserande som kan vara vägledande för krampanfall. Beslag är ofta förknippat med en komprometterad dura. Tillsammans utgör dessa fynd tyder på att skadan orsakar neurologiska skador. Sham djur är anslutna till LFP enheten men pendeln är inte släppt. För att visualisera de skador som orsakas av LFP har vi utfört immuncytokemi använda antikroppar som känner igen astrocyter och makrofager som båda celltyper i samband med ett svar på skada. Gliaceller fibrillära Sura protein (GFAP) färgning avslöjar ökat gliosis hela hjärnbarken i regionen skada WHereas bluff möss visas inte ökat astrocytosis på motsvarande plats under craniectomy (Figur 2A, B). Likaså visar Mac1 färgning fler makrofager kring platsen för skadan jämfört med möss som utsätts för bluff kirurgi. Dessutom finns det ofta fysiska skador på hjärnbarken vävnaden syns hos möss utsatta för LFP, men inte i falska möss (Figur 2C, D). Behavioral testa följande mild LFP kan användas för att bedöma både kognitiva och motoriska resultat. MWM används för att bestämma effekter på inlärning och minne. Använda visuella ledtrådar i test rummet blev bluff möss snabbt effektivare på att hitta plattformen med varje följande dag av träning i vattnet labyrint. Möss utsatts för mild LFP ta längre tid att hitta de dolda plattformen på de första två dagarna av tester i förhållande till falsk möss men sedan verkar lära sig uppgiften av den tredje dagen (Figur 3A). Dessa resultat tyder på att skadan minskar hastigheten med vilken mössen kan få rumsliga lärande. För att bestämma effekten av skada på minne retention är en sond försök utförs en dag efter det sista träningspasset. Sham möss tillbringa mer tid i målet kvadranten jämfört med de möss som utsätts för milda LFP tyder på att skadan har påverkat möjligheten för mössen att komma ihåg platsen där plattformen används för att bosätta sig (figur 3B). För att bedöma rörelseapparaten fungerar, är möss testas på rotarod enhet. Möss utsatts för mild LFP har kortare genomsnittlig latens att falla jämfört med bluff möss vid 1, 7 och 21 dagar efter skada (dpi) (Figur 3C). Dessa data tyder på att skadade möss har nedsatt integrerade vestibulomotor och sensomotoriska funktion. Figur 1. LFP-enhet och en representant spår av oscilloskopet erhållits under skada. A) Komponenterna i LFP enheten: pendeln fast på ett stativ och ställ in i en vinkel förutbestämt att leverera önskad kraft, en vattenfylld akryl cylinder med högt tryck slang och en hane Luer-lok montering bifogas, en förstärkare, och ett oscilloskop. B) Representativa spår av trycket puls från oscilloskopet. I topp-till-topp värdet är 2,16 volt indikerar ett tryck av 1,47 atm. Figur 2. Förbättrad gliosis och ett inflammatoriskt svar efter LFP visar omfattningen av skadan. Frysta tvärgående profiler (20 mikroM) genom hjärnan på en mus utsatt för bluff kirurgi (A, C) eller LFP skada (B, D) 7 dagar efter skadan (dpi). Kortikala bilder tas vid epicentrum craniectomy. (A, B) Tissue är färgade med en antikropp för att identifiera astrocyter. Gliaceller fibrillära Sura protein (GFAP) antikropp (MAB360, Chemicon, 1:400) visar ett ökat antal astrocyter hela cortex av musen utsätts för LFP skada (pilar) jämfört med simulerad kirurgi. Sekundär antikropp är get-anti-mus 594 (1:1000). (C. D) Tissue är färgade med en antikropp för att identifiera makrofager. Mac1 antikropp (Mac1-alfa-kedjan CD11b, BD Biosciences, 1:50) avslöjar fler macrophges och / eller aktiverade mikroglia kring platsen för skadan i cortex (pilar) jämfört med simulerad kirurgi. Sekundär antikropp är get anti råtta CY3 (1:50). Skala bar = 200μm i A och B, 100μm i C och D. Figur 3. Behavioral testa följande milda LFP visar underskott i skadade jämfört med bluff möss. A) Möss utsätts för milda LFP ta längre tid att lära sig uppgiften att hitta plattformen i MWM än bluff möss. Sham vs LFP (AVE sekunder ± SEM) 1 dag 34,21 ± 3,02 vs 38,64 ± 2,63, 2 dagar 24,52 ± 2,84 vs 27,21 ± 2,11, 3 dagar 22,47 ± 2,00 vs 22,08 ± 2,52 (1 dpi, n = 9 bluff, 10 LFP) . B) Möss utsatts för mild LFP spendera mindre tid i målet kvadranten under sonden rättegången 24 tim efter sista träning i MWM förhållande till bluff möss (21 dpi, n = 10). C) Möss utsatts för mild LFP ramla av rotarod enheten tidigare än bluff möss (1, 7 och 21 dpi, n = 5 bluff, 8 LFP). Felstaplar representerar SE.