الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي
Summary
Tregs والمكثفات قوية من الجهاز المناعي. هناك عدم وجود علامات سطح فريدة لتعريف بهم ، وبالتالي ، تعريفات Tregs وظيفية في المقام الأول. نحن هنا تصف الأمثل<em> في المختبر</em> مقايسة قادرة على تحديد الخلل المناعي في المواد المعرضة للخطر لتطوير T1D.
Abstract
التنظيمية خلايا T (Tregs) هي الحاسمة وسطاء التسامح المناعي في تقرير المصير ، مستضدات. بالإضافة إلى ذلك ، هم المنظمين الحاسمة للاستجابة مناعية بعد العدوى. على الرغم من الجهود المبذولة لتحديد علامة فريدة من نوعها على سطح Tregs ، الميزة الفريدة فقط هو قدرتها على منع انتشار الأسلحة النووية وظيفة الخلايا التائية المستجيب. في حين أنه من الواضح أن المقايسات فقط في المختبر يمكن استخدامها في تقييم وظيفة Treg الإنسان ، وهذا يصبح مشكلة عند تقييم النتائج من دراسات مستعرضة فيها الخلايا السليمة والخلايا المعزولة من الموضوعات مع أمراض المناعة الذاتية (مثل مرض السكري نوع 1 – T1D) الحاجة ويمكن مقارنة. هناك تفاوت كبير بين المختبرات في عدد ونوع من الخلايا التائية المستجيب وطبيعة وقوة التحفيز ، Treg : نسب المستجيب وعدد ونوع من خلايا مولدة تقديم (APC) المستخدمة في قمع الإنسان في فحوصات المختبر. هذا التباين يجعل المقارنة بين الدراسات قياس وظيفة Treg صعبة. الحقل Treg يحتاج الى فحص قمع موحدة من شأنها أن تعمل بشكل جيد مع كل من الاشخاص الاصحاء والمصابين بأمراض المناعة الذاتية. طورنا في الفحص المختبري القمع الذي يظهر القليل جدا من داخل مقايسة التباين في تحفيز خلايا تي المعزولة من المتطوعين الأصحاء مقارنة مع الموضوعات الأساسية تدمير المناعة الذاتية للخلايا البنكرياس β. الهدف الرئيسي لهذه القطعة لوصف تجربة في المختبر قمع الإنسان أن يسمح بإجراء مقارنة بين مجموعات مختلفة الموضوع. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الاختبار لديه القدرة على رسم خسارة صغيرة في nTreg وظيفة وتوقع مزيد من الخسائر في المستقبل ، ومن ثم تحديد الموضوعات التي يمكن أن تستفيد من المعالجة المناعية الوقائية 1. أدناه ، ونحن نقدم وصف دقيق للخطوات التي ينطوي عليها هذا الإجراء. نأمل أن تسهم في توحيد في المختبر فحص قمع المستخدمة لقياس وظيفة Treg. بالإضافة إلى ذلك ، فإننا نقدم هذا الاختبار كأداة ليتعرف على الدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي والعلامات البيولوجية المحتملة وظيفية للT1D.
Protocol
Discussion
والميزة الفريدة فقط لTregs ، يجب اختبار الوظيفة القمعية وموثوق بها بشكل موحد بين الموضوعات في مختلف مراحل تطور المرض داخل نفسه ، وبين الدراسات المختلفة. ونحن نقدم تفاصيل قمع مقايسة وضعت في مختبرنا ومساهمتنا في توحيد هذا الاختبار. في دراستنا التحسين واسعة ، ونحن مصممون …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة ماكجي ماكس المركز القومي للبحوث الطبية لكلية Diabetesat الأحداث ويسكونسن وطفولة معهد البحوث ويسكونسن. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها ، أو في الإعداد للمخطوطة.
Materials
| Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham Pharmacia Biotech | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | Gibco | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Pharmingen | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Pharmingen | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Pharmingen | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Pharmingen | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Pharmingen | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Pharmingen | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Homemade | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Homemade | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Homemade | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Homemade | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | Perkin Elmer | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | Perkin Elmer | 6013621 |
References
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
- Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
- Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
- Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
- Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
- Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
- Major, J. L., Meade, T. J. B. i. o. r. e. s. p. o. n. s. i. v. e. Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
- Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
- Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
- Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
- Yoo, B., Pagel, . An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
- Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
- Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
- Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
- Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -. C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
- Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).
