Tregs sont suppresseurs puissants du système immunitaire. Il ya un manque de marqueurs de surface unique de les définir, par conséquent, les définitions des Treg sont principalement fonctionnelle. Nous décrivons ici une optimisation In vitro Test capable d'identifier déséquilibre immunitaire chez les sujets à risque de développer le DT1.
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Article de méthode
Homme In Vitro comme outil de dépistage pour la reconnaissance d'un Etat précoce de déséquilibre immunitaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules T régulatrices (Treg) sont des médiateurs essentiels de la tolérance immunitaire aux antigènes du soi. De plus, ils sont des régulateurs essentiels de la réponse immunitaire après une infection. Malgré les efforts pour identifier les marqueurs de surface unique sur Tregs, la seule caractéristique unique est leur capacité à supprimer la prolifération et la fonction des lymphocytes T effecteurs. Alors qu'il est clair que seuls les essais in vitro peuvent être utilisés pour évaluer la fonction Treg humains, cela devient problématique lorsque l'évaluation des résultats à partir des études transversales où les cellules saines et les cellules isolées de sujets atteints de maladies auto-immunes (comme diabète de type 1-DT1) doivent être comparés. Il ya une grande variabilité entre les laboratoires dans le nombre et le type de cellules T intervenant, la nature et la force de stimulation, Treg: ratios répondeur et le nombre et le type de cellules présentatrices d'antigènes (APC) utilisés en médecine humaine dans les tests in vitro de suppression. Cette variabilité rend la comparaison entre les études mesurant la fonction Treg difficile. Le champ Treg a besoin d'un test de suppression standardisé qui va bien travailler avec des sujets sains et ceux atteints de maladies auto-immunes. Nous avons élaboré une épreuve suppression in vitro qui montre que très peu la variabilité intra-essai dans la stimulation des cellules T isolées chez des volontaires sains par rapport aux sujets avec une destruction auto-immune sous-jacente du pancréas β-cellules. L'objectif principal de cette pièce est de décrire un essai in vitro de suppression humaine qui permet la comparaison entre les groupes de sujets différents. De plus, ce test a le potentiel pour délimiter une petite perte de fonction et d'anticiper nTreg d'autres pertes dans le futur, donc sujets identification qui pourraient bénéficier d'une thérapie immunomodulatrice préventives 1. Ci-dessous, nous fournir une description approfondie des différentes étapes de cette procédure. Nous espérons contribuer à la standardisation de l'analyse de suppression in vitro utilisé pour mesurer la fonction Treg. En outre, nous offrons ce test comme outil de reconnaître un état de déséquilibre début immunitaire et un biomarqueur potentiel fonctionnel pour DT1.
Protocole
1. Avant de mettre en place un test de suppression, on a besoin de perles robe tosylactivated avec des anti-CD3 humain (clone UCHT1, 1μg/ml concentration finale) pour la stimulation des cellules et par la suite vérifier si les perles sont efficacement revêtus par la création d'une prolifération in vitro de dosage à l'aide humaine Les cellules T
- Prenez 1ml de M-450 perles tosylactivated du flacon d'origine, lieu support magnétique et maintenez jusqu'à ce que toutes les perles ont adhéré à la paroi du tube. Retirez le tampon tandis tube est toujours dans le support magnétique. Prenez le tube de support magnétique et ajouter 1ml de buffer1, ....
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Discussion
Comme la seule caractéristique unique de Tregs, fonction suppressive doit être testé de façon fiable et uniforme entre les sujets à différentes phases de développement de la maladie dans les mêmes et entre les différentes études. Nous vous proposons des détails sur le test de suppression développés dans notre laboratoire que notre contribution à la standardisation de ce dosage. Dans notre étude d'optimisation approfondie, nous avons déterminé que la stimulation des cellules T avec des anti-CD3 humain billes recouver.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Cette étude a été soutenue par Max McGee Centre national de recherche pour les jeunes Diabetesat Medical College of Wisconsin et l'enfance Institut de recherche du Wisconsin. Les bailleurs de fonds n'a joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte de données et d'analyse, ou de la préparation du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif ou d'un instrument | Société | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham Pharmacia Biotech | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | Gibco | 14190-144 | |
| Bleu Trypan | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbilles | Miltenyi | 130-045-101 | |
| Pré-filtres de séparation | Miltenyi | 130-041-407 | |
| Colonne de LS | Miltenyi | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-CD4 humain APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Pharmingen | 557852 | |
| Anti-CD25-PE humains (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Pharmingen | 555432 | |
| Anti-CD8 humain-FITC (clone RPA-T8) | BD Pharmingen | 555366 | |
| Anti-CD14 humain-FITC (clone M5E2; récepteurs LPS) | BD Pharmingen | 555397 | |
| Anti-CD32-FITC humain (clone FLI8.26; FcyR type II) | BD Pharmingen | 555448 | |
| Anti-humain CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chaîne) | BD Pharmingen | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-CD3 humain | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Homemade | 0,1 M Na 2 B 4 O 7 pH 7,6 | |
| Buffer2 | Homemade | PBS/2mM EDTA / BSA 0,1% pH 7,4 | |
| Buffer3 | Homemade | 0,2% de BSA Tris/0.1 pH 8,5 | |
| RPMI complet des médias | Homemade | Du milieu RPMI 1640 2 mM L-glutamine 100 mM HEPES 5 U / pg / ml pénicilline / strept 0,5 mM pyruvate de sodium | |
| [3 H] thymidine | Perkin Elmer | NET027Z005MC | |
| humains mis en commun sérum AB | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Plaque de la récolte Multiscreen | Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | Perkin Elmer | 6013621 |
Références
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
- Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R.
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Réimpressions et autorisations
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