Normale volwassen gevasculariseerde weefsel van zoogdieren die fysiologische angiogenese en die mist nog niet is blootgesteld aan chirurgische ingreep wordt gebruikt om te bestuderen: (i) de instelling en ontwikkeling van angiogenese na intraperitoneale toediening van test-agenten, en (ii) wijziging van angiogenese na systemische toediening van geselecteerde test agenten.
De volwassen rat mesenterium venster angiogenese assay is biologisch passend en is bij uitstek geschikt voor de studie van kiemen angiogenese in vivo [zie review papers], dat is de dominante vorm van angiogenese in de menselijke tumoren en niet-tumor weefsel, zoals besproken in uitgenodigde herziening papers 1,2. Angiogenese geïnduceerd in het membraneuze mesenteriale onderdelen door intraperitoneale (ip) injectie van een pro-angiogene factor kan gemoduleerd worden door subcutane (sc), intraveneus (iv) of orale (po) behandeling met het wijzigen agenten van keuze. Elk membraneuze deel van het mesenterium is doorschijnend en omlijst door vetweefsel, waardoor het een window-achtige uitstraling.
De test heeft de volgende gunstige eigenschappen: (i) de test weefsel is native gevasculariseerd, zij het mondjesmaat, en omdat het is extreem dun, het microvessel netwerk is zo goed als twee-dimensionale, waardoor het hele netwerk om microscopisch worden beoordeeld in situ; ( ii) bij volwassen ratten de test weefsel mist belangrijke fysiologische angiogenese, die de meeste normale volwassen weefsels zoogdieren kenmerkt, de mate van inheemse vascularisatie is echter gecorreleerd met de leeftijd, zoals besproken in een, (iii) het verwaarloosbaar niveau van de trauma-geïnduceerde angiogenese zorgt voor een hoge gevoeligheid, (iv) de test een replica van de klinische situatie, aangezien de angiogenese-modulerende testen drugs zijn systemisch toegediend en de responsen waargenomen weerspiegelen het netto-effect van alle metabolische, cellulaire en moleculaire veranderingen veroorzaakt door de behandeling, (v) de assay kunnen evaluaties van objectieve, kwantitatieve, onpartijdige variabelen van microvasculaire ruimtelijke uitbreiding, dichtheid, en netwerk patroonvorming, evenals van capillaire kiemen, waardoor robuuste statistische analyses van de dosis-effect en moleculaire structuur-activiteit relaties, en (vi ) de test laat zien met een hoge gevoeligheid van de toxische of schadelijke effecten van behandelingen op het gebied van verminderde mate van fysiologische lichaamsgewicht te winnen, als volwassen ratten groeien robuust.
Mast-cel-gemedieerde angiogenese werd voor het eerst aangetoond met behulp van deze test 3,4. Het model toont een hoge mate van discriminatie ten aanzien van dosis-effect relaties en de gemeten effecten van systemisch toegediende chemisch of functioneel nauw verwante drugs en eiwitten, waaronder: (i) een lage dosering, metronomically toegediende standaard chemotherapeutica dat diverse, drug-specifieke effecten opleveren (dat wil zeggen, angiogenese-onderdrukkende, neutraal of angiogenese-stimulerende activiteiten 5), (ii) natuurlijke ijzer-onverzadigde humaan lactoferrine, dat VEGF-A-gemedieerde angiogenese 6 stimuleert, en natuurlijk ijzer-onverzadigde runderen lactoferrine, dat remt VEGF-A- gemedieerde angiogenese 7, en (iii) een laag-moleculair-gewicht heparine fracties geproduceerd door verschillende manieren 8,9. Bovendien is de test zeer geschikt voor studies naar de gecombineerde effecten op de angiogenese van de agenten die systemisch worden toegediend in een gelijktijdige of opeenvolgende mode.
Het idee van het maken van deze video is ontstaan uit de late dr. Judah Folkman toen hij een bezoek bracht ons laboratorium en was getuige van de methodiek wordt gedemonstreerd.
Overzichtsartikelen (uitgenodigd) bespreken en de beoordeling van de test
Norrby, K. In vivo modellen van angiogenese. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testen met angiogenese modellen. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).
De test werd geïntroduceerd in 1986 3 en is achtereenvolgens verder ontwikkeld en verfijnd in ons laboratorium 7,10-12. Zoals besproken in review papers (uitgenodigde) 1, 2, de test vergelijkt goed met andere zoogdieren in vivo angiogenese assay in name gelet op belangrijke functies, zoals de volwassen-test weefsel is native gevasculariseerd en mist fysiologische angiogenese, minimaal trauma, indien van toepassing, is toegebracht aan het weefsel; echt kwantitatieve variabelen worden gemeten, wat een goede statistische analyse met betrekking tot de dosis-respons en moleculaire-activiteit studies mogelijk maakt; kiemen angiogenese voordoet, die overwegend in normale weefsels en tumoren, en toxiciteit zijn eenvoudig opgebouwd in ratten die robuust groeien fysiologisch op volwassen leeftijd. Nadelig functies kunnen zijn het feit dat de test is relatief veel tijd in beslag, in het bijzonder bij de beoordeling van het aantal en de lengte van de individuele microvessel segmenten en microvessel spruiten, dat het niet real-time/serial waarnemingen mogelijk te maken; en dat is nauwelijks geschikt voor muizen omdat veel mesenteriale ramen in muizen gebrek aan potentiële ouder haarvaten van waaruit nieuwe haarvaten kan ontstaan.
Real-time waarnemingen zijn echter mogelijk gemaakt door intravitale microscopie, waar de exteriorized maar intact mesenteriale ramen zijn uit gespreid over een microscoop podium terwijl het dier onder narcose is, zoals besproken in een.
Aanzienlijke vooruitgang in angiogenese onderzoek zijn bereikt in de afgelopen decennia met behulp van modellen zoals de hoornvlies micropocket, chick chorion-membraan, en sc Matrigel plug assays, die nuttig zijn, maar uiteindelijk beperkt tools. Toekomstige klinische toepassingen van anti-angiogene en pro-angiogene therapieën noodzakelijk de vestiging en de validatie van meer gevoelige en biologisch relevante, echt kwantitatieve pre-klinische modellen, zoals die wordt beschreven in het huidige rapport.
The authors have nothing to disclose.
Financiële ondersteuning voor de meeste van de studies werd verstrekt door de Zweedse Medical Research Council (subsidie 5942).
Buffers and reagents
0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution
Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.
Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
TBS (pH 7.4)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2)
Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8).
Sucrose solution 2.5%
Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).
Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4)
Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).
Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide
(Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).
ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG
Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer.
Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer.
ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).
Mix these solutions 20 minutes before use!
Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)
Catalog # | ARU0181 |
Clone # | MRC OX-43 |
This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.
Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit
The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.
Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503).
DAB= 3,3′-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015).
Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665).
Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)