Tests biophysiques pour sonder les propriétés mécaniques du noyau cellulaire interphase: Application Strain Substrat et manipulation Microneedle
Summary
Nous présentons deux indépendantes, basées sur le microscope des outils pour mesurer les déformations induites nucléaire et du cytosquelette dans la seule, vivant des cellules adhérentes en réponse à l'application de déformation globale ou localisée. Ces techniques sont utilisées pour déterminer la rigidité nucléaire (ie, déformabilité) et de transmission de la force de sonde intracellulaire entre le noyau et le cytosquelette.
Abstract
Dans la plupart des cellules eucaryotes, le noyau est le plus grand organite et est généralement de 2 à 10 fois plus rigide que le cytosquelette entourant, par conséquent, les propriétés physiques du noyau contribuer de manière significative au comportement global biomécanique de cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. Par exemple, dans la migration des neutrophiles et des cellules de cancer envahissant, de la raideur nucléaire peut constituer un obstacle majeur au cours d'extravasation ou de passage dans des espaces étroits au sein des tissus. 1 D'autre part, le noyau des cellules dans les tissus mécaniquement actives comme les muscles nécessite suffisamment de soutien structurel à résister aux contraintes mécaniques répétitives. Fait important, le noyau est étroitement intégré dans l'architecture cellulaire, il est physiquement connecté au cytosquelette environnante, qui est une exigence essentielle pour le mouvement intracellulaire et le positionnement du noyau, par exemple, dans les cellules polarisées, les noyaux synaptiques au niveau des jonctions neuromusculaires, ou dans les cellules en migration. 2 Sans surprise, les mutations dans les protéines de l'enveloppe nucléaire tels que les lamines et nesprins, qui jouent un rôle crucial dans la détermination de la raideur nucléaire et nucléo-cytosquelette d'accouplement, il a été démontré récemment pour donner lieu à un certain nombre de maladies humaines, y compris d'Emery- Dreifuss dystrophie musculaire, myopathie des ceintures dystrophie musculaire et une cardiomyopathie dilatée. 3 Pour étudier la fonction des divers biophysique des protéines de l'enveloppe nucléaire et l'effet de mutations spécifiques, nous avons développé des méthodes expérimentales pour étudier les propriétés physiques du noyau en version simple, les cellules vivantes soumis à des perturbations mécaniques globales ou localisées. Mesure des déformations induites nucléaire en réponse à la demande substrat souche justement appliquée fournissent des informations importantes sur la déformabilité du noyau et permet une comparaison quantitative entre les différentes mutations ou des lignées cellulaires déficientes pour les protéines spécifiques de l'enveloppe nucléaire. Localisé application de souche du cytosquelette avec une micro-aiguille est utilisée pour compléter ce test et peuvent fournir des informations additionnelles sur la transmission intracellulaire vigueur entre le noyau et le cytosquelette. Etudier la mécanique nucléaire dans les cellules vivantes intactes préserve l'architecture normale intracellulaire et évite les artefacts potentiels qui peuvent survenir lorsque vous travaillez avec des noyaux isolés. Par ailleurs, l'application de contrainte substrat présente un bon modèle pour le stress physiologique expérimentés par des cellules dans les tissus musculaires ou autres (par exemple, cellules musculaires lisses vasculaires exposés à la souche du navire). Enfin, alors que ces outils ont été développés principalement pour étudier la mécanique nucléaire, ils peuvent également être appliquées pour étudier la fonction des protéines du cytosquelette et de signalisation mécanotransduction.
Protocol
Discussion
Dosage de souche Substrat
L'application souche a été utilisée avec succès par nous et d'autres groupes pour étudier les déformations induites nucléaire dans des cellules soumises à des contraintes mécaniques et à enquêter sur la contribution des protéines spécifiques de l'enveloppe nucléaire à la rigidité nucléaires. 4-8 L'avantage de cette technique est qu'elle sondes propriétés mécaniques noyaux de vie dans leur environnement cellulaire et du…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (R01 et R01 HL082792 NS059348) et le Brigham and Women Award de l'Hôpital de cardiologie Leadership Group.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Fibronectin | Millipore | FC010 |
| MitoTracker Red FM and Green FM | Invitrogen | M22425 and M-7514 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 |
| Hank’s Buffered Salt Saline | Invitrogen | 14185 |
| Phenol free, DMEM | Invitrogen | 21063 |
| Fetal bovine serum | Aleken Biologicals | FBSS500 |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P0781-100ML |
| Borosilicate Glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 |
| Gloss/Gloss non-reinforced silicone sheeting, 0.005″ | Specialty Manufacturing Inc. | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14200 |
| 35 mm glass bottom culture dishes (FluoroDish) | World Precision Instruments, INC | FD35-100 |
| Braycote 804 Vacuum Grease | Spi supplies | 05133A-AB |
References
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