Biophysikalische Assays auf die mechanischen Eigenschaften der Interphase Zellkern Probe: Substrat Dehnungs-Anwendung und Mikronadel Manipulation
Summary
Wir stellen zwei unabhängige, Mikroskop-basierten Tools zur induzierten Nuklear-und Zytoskelett-Verformungen in Einzel-, Wohn adhärente Zellen in Reaktion auf die globale oder lokale Dehnung Anwendung zu messen. Diese Techniken werden verwendet, um nukleare Steifigkeit (dh, Verformbarkeit) zu ermitteln und intrazellulären Kraftübertragung zwischen dem Kern und dem Zytoskelett-Sonde.
Abstract
In den meisten eukaryotischen Zellen ist der Kern der größten Organelle und ist in der Regel 2 bis 10 mal steifer als die umgebenden Zytoskeletts, folglich tragen die physikalischen Eigenschaften des Kerns wesentlich zur umfassenden biomechanischen Verhalten von Zellen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Zum Beispiel bei der Migration von Neutrophilen und eindringende Krebszellen, nukleare Steifigkeit kann ein großes Hindernis bei der Extravasation oder Durchfahrt durch Engstellen im Gewebe darstellen. 1 Auf der anderen Seite erfordert der Kern der Zellen in mechanisch aktive Gewebe wie Muskeln ausreichende strukturelle Unterstützung standhalten repetitive mechanische Beanspruchung. Wichtig ist, dass der Kern fest in der zellulären Architektur integriert, es ist physikalisch mit dem umgebenden Zytoskelett, das eine entscheidende Voraussetzung für die intrazelluläre Bewegung und Positionierung des Kerns, zum Beispiel in polarisierten Zellen, synaptische Kerne an neuromuskulären Synapsen verbunden ist, oder bei der Migration von Zellen. 2 Nicht überraschend, dass Mutationen in Kernhüllenproteine wie Lamine und nesprins, die eine entscheidende Rolle spielen bei der Bestimmung nuklearen Steifigkeit und nucleo-Zytoskelett-Kopplung, wurden kürzlich in einer Reihe von menschlichen Krankheiten, darunter ausgewiesen Emery- Dreifuss Muskeldystrophie, Körper-Muskeldystrophie und Kardiomyopathie. 3 Um die biophysikalischen Funktion der verschiedenen Kernhüllenproteine und die Wirkung der spezifischen Mutationen zu untersuchen, haben wir experimentelle Methoden, um die physikalischen Eigenschaften des Kerns in einzelnen lebenden Zellen Studie entwickelt unterzogen, um globale oder lokale mechanische Störung. Mess-induzierte atomare Verformungen in Reaktion auf genau angewendet Substrat Belastung Anwendung liefert wichtige Informationen über die Verformbarkeit des Kerns und ermöglicht quantitative Vergleich zwischen verschiedenen Mutationen oder Zelllinien Mangel für bestimmte Kernhüllenproteine. Lokalisierte Zytoskelett-Dehnungs-Anwendung mit einer Mikronadel wird verwendet, um diesen Test zu ergänzen und zusätzliche Informationen über die intrazelluläre Kraftübertragung zwischen dem Kern und dem Zytoskelett Ertrag. Studieren nuklearen Mechanik in intakten lebenden Zellen erhält die normale intrazelluläre Architektur und vermeidet mögliche Artefakte, die entstehen, wenn die Arbeit mit isolierten Kernen kann. Darüber hinaus präsentiert Substrat Belastung Anwendung ein gutes Modell für die physiologischen Stress, der durch Zellen in Muskel oder anderen Geweben (zB vaskuläre glatte Muskelzellen Schiff Belastungen ausgesetzt) erlebt. Schließlich, während diese Werkzeuge wurden in erster Linie die nukleare Mechanik Studie entwickelt, können sie auch angewendet, um die Funktion des Zytoskelett-Proteine und Mechanotransduktion Signalisierung zu untersuchen.
Protocol
Discussion
Substrat-Stamm-Test
Dehnungs-Anwendung wurde erfolgreich von uns und anderen Gruppen verwendet werden, um induzierte atomare Verformungen in den Zellen unterzogen, um mechanische Belastungen zu untersuchen und den Beitrag der spezifischen Kernhüllenproteine der nuklearen Steifigkeit zu untersuchen. 4-8 Der Vorteil dieser Technik ist, dass es Sonden mechanischen Eigenschaften Lebensstandard Kerne in ihrer normalen zellulären und Zytoskelett-Umgebung und das Substrat Belastung …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01 HL082792 und R01 NS059348) und dem Brigham and Women Hospital Cardiovascular Leadership Group-Award unterstützt.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Fibronectin | Millipore | FC010 |
| MitoTracker Red FM and Green FM | Invitrogen | M22425 and M-7514 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 |
| Hank’s Buffered Salt Saline | Invitrogen | 14185 |
| Phenol free, DMEM | Invitrogen | 21063 |
| Fetal bovine serum | Aleken Biologicals | FBSS500 |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P0781-100ML |
| Borosilicate Glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 |
| Gloss/Gloss non-reinforced silicone sheeting, 0.005″ | Specialty Manufacturing Inc. | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14200 |
| 35 mm glass bottom culture dishes (FluoroDish) | World Precision Instruments, INC | FD35-100 |
| Braycote 804 Vacuum Grease | Spi supplies | 05133A-AB |
References
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