Biofysiska analyser för att undersöka mekaniska egenskaper Interphase cellkärnan: grundmaterial Sila Ansökan och Microneedle Manipulation
Summary
Vi presenterar två oberoende, mikroskop-baserade verktyg för att mäta den inducerade kärnkraft och cytoskelettala deformationer i singel, lever fastsittande celler som svar på globala eller lokala stam ansökan. Dessa tekniker används för att bestämma nukleära stelhet (dvs deformerbarhet) och sond intracellulära kraftöverföring mellan kärnan och cytoskelettet.
Abstract
I de flesta eukaryota celler, är kärnan största organell och är vanligen 2 till 10 gånger styvare än det omgivande cytoskelettet, varför de fysiska egenskaperna hos kärnan väsentligt bidra till den totala biomekaniska beteende celler under fysiologiska och patologiska förhållanden. Till exempel i flyttande neutrofiler och invaderande cancerceller kan kärnkraft stelhet utgöra ett stort hinder vid extravasering eller passage genom smala utrymmen i vävnader. 1 Å andra sidan kräver den kärna av celler i mekaniskt aktiv vävnad såsom muskler tillräckligt strukturstöd till tåla upprepade mekaniska påfrestningar. Viktigt är kärnan tätt integrerade i den cellulära strukturen, det är fysiskt ansluten till den omgivande cytoskelettet, vilket är ett viktigt krav för den intracellulära förflyttning och positionering av kärnan, exempelvis i polariserade celler, synaptiska kärnor vid neuromuskulära korsningar, eller att migrera celler. 2 Föga förvånande har mutationer i kärnhöljet proteiner såsom lamins och nesprins, som spelar en avgörande roll för hur kärnkraft styvhet och Nucleo-cytoskelettala kopplingen visats nyligen att resultera i ett antal mänskliga sjukdomar, bland annat Emery- Dreifuss muskeldystrofi, lem-gördel muskeldystrofi och dilaterad kardiomyopati. 3 Att undersöka biofysiska funktion av olika kärnhöljet proteiner och effekten av specifika mutationer har vi utvecklat experimentella metoder för att studera de fysiska egenskaperna hos kärnan i enda, levande celler utsätts för global eller lokal mekanisk störning. Mätning inducerad kärnkraft deformationer som svar på exakt tillämpas substrat stam ansökan ger viktig information om deformerbarhet av kärnan och tillåter kvantitativa jämförelser mellan olika mutationer eller cellinjer bristfällig för specifika kärnhöljet proteiner. Lokaliserad cytoskelettala stam ansökan med en microneedle används som komplement till denna analys och kan ge ytterligare information om intracellulära kraftöverföring mellan kärnan och cytoskelettet. Att studera kärnkraft mekaniker i intakta levande celler bevarar den normala intracellulära arkitektur och undviker potentiella artefakter som kan uppstå när man arbetar med enstaka kärnor. Dessutom presenterar substrat stam ansökan en bra modell för fysiologisk stress som upplevs av celler i muskler eller andra vävnader (t.ex. vaskulär glatt muskulatur celler som utsätts för fartyg stam). Slutligen är dessa verktyg har utvecklats främst för att studera kärnkraft mekaniker, kan de också användas för att undersöka funktionen hos cytoskelettala proteiner och signalering mechanotransduction.
Protocol
Discussion
Substrat stam analys
Sila ansökan med framgång har använts av oss och andra grupper för att studera inducerade kärnkraft deformationer i celler utsätts för mekanisk stress och att undersöka bidrag från särskilda kärnhöljet proteiner till kärnkraft stelhet. 4-8 Fördelen med denna teknik är att den sonder mekaniska egenskaper att leva kärnor i sin normala cellulära och cytoskelettala miljö och att substratet stammen ansökan liknar fysiologiska belastning ansökan som…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R01 HL082792 och R01 NS059348) och Brigham and Women sjukhus Hjärt Leadership Group Award.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Fibronectin | Millipore | FC010 |
| MitoTracker Red FM and Green FM | Invitrogen | M22425 and M-7514 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 |
| Hank’s Buffered Salt Saline | Invitrogen | 14185 |
| Phenol free, DMEM | Invitrogen | 21063 |
| Fetal bovine serum | Aleken Biologicals | FBSS500 |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P0781-100ML |
| Borosilicate Glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 |
| Gloss/Gloss non-reinforced silicone sheeting, 0.005″ | Specialty Manufacturing Inc. | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14200 |
| 35 mm glass bottom culture dishes (FluoroDish) | World Precision Instruments, INC | FD35-100 |
| Braycote 804 Vacuum Grease | Spi supplies | 05133A-AB |
References
- Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. Nuclear mechanics during cell migration. Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).
- Mejat, A., Misteli, T. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1, 40-52 (2010).
- Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy. J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).
- Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate. Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).
- Lammerding, J. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).
- Lammerding, J. Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells. J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).
- Lammerding, J. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
- Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors. Aging Cell. 7, 383-393 (2008).
- Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488, 459-469 (1995).
- Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure. Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).
