Fazlararası Hücre Çekirdek Mekanik Özellikleri Probe Biyofiziksel Tahliller: Yüzey Gerilme Uygulama ve Microneedle Manipülasyon
Summary
Biz, küresel ya da lokalize gerginlik uygulama yanıt tek, yaşayan yapışık hücrelere kaynaklı nükleer ve iskelet deformasyonları ölçmek için, iki bağımsız, mikroskop tabanlı araçlar sunuyoruz. Bu teknikler, nükleer sertliği belirlemek için (yani, deformabilitesi) ve, çekirdek ve hücre iskeletinin arasındaki hücre içi kuvvet iletim prob kullanılır.
Abstract
Çoğu ökaryotik hücre çekirdeği büyük organel ve genellikle çevresindeki hücre iskeletinin daha 2 ila 10 kat daha sert, dolayısıyla çekirdeğin fiziksel özelliklerini, fizyolojik ve patolojik koşullar altında hücre genel biyomekanik davranış önemli ölçüde katkıda bulunur. Örneğin, nötrofil göç ve kanser hücreleri istila, nükleer sertlik dokuların içindeki dar alanlarda yoluyla ekstravazasyonu veya geçiş sırasında büyük bir engel teşkil edebilir. 1 Öte yandan, böyle bir kas gibi mekanik olarak aktif bir doku hücrelerinin çekirdeği için yeterli yapısal destek gerektirir tekrarlayan mekanik stres dayanacak. Önemlisi, çekirdeğinde sıkı bir şekilde hücresel mimarisine entegre; fiziksel polarize hücreler, nöromüsküler kavşaklarda sinaptik çekirdekleri örneğin çekirdeğin hücre içi hareket ve konumlandırma için kritik bir gereklilik, çevredeki hücre iskeletinin, bağlı, ya da göç hücrelerinde 2 şaşırtıcı değil, nükleer sertliği ve Nucleo iskelet kaplin belirlenmesinde kritik bir rol oynayan lamins ve nesprins gibi çekirdek zarı proteinleri mutasyonlar, bir numara da dahil olmak üzere insan hastalıkları, neden son zamanlarda gösterilen edilmiştir Emery- Dreifuss müsküler distrofi, kol, bacak-girdle musküler distrofi ve dilate kardiyomiyopati 3 biyofiziksel fonksiyonu çeşitli çekirdek zarı proteinleri ve belirli mutasyonların etkisini araştırmak için, tek, canlı hücrelerin çekirdeğinde fiziksel özelliklerini incelemek için deneysel yöntemler geliştirdik küresel veya lokalize mekanik pertürbasyon tabi. Tam olarak uygulandığında yüzey gerilme uygulama yanıt indüklenen nükleer deformasyonlar Ölçüm çekirdeğin deformabilitesi hakkında önemli bilgiler verir ve farklı mutasyon veya özel nükleer zarf proteinlerin eksik hücre hatları arasında kantitatif karşılaştırılmasına olanak sağlar. Bir microneedle lokalize sitoskeletal gerginlik uygulaması bu testte tamamlamak için kullanılır ve çekirdek ve hücre iskeletinin arasındaki hücre içi kuvvet aktarımı hakkında ek bilgi verim alınabilir. Bozulmamış canlı hücreler nükleer mekaniğinin incelenmesi, normal hücre içi mimariyi korur ve izole çekirdekleri ile çalışırken ortaya çıkabilecek potansiyel eserler önler. Ayrıca, yüzey gerilme uygulama, fizyolojik stres, kas hücreleri ve diğer dokulara (örneğin, damar düz kas hücrelerinin damar zorlamalara maruz) tarafından deneyimli iyi bir model sunar. Son olarak, bu araçların, öncelikle nükleer mekaniği çalışma geliştirilmiştir ise aynı zamanda iskelet proteinleri ve mechanotransduction sinyal fonksiyonu araştırmak için uygulanan olabilir.
Protocol
Discussion
Yüzey gerilme tahlil
Gerilme uygulamanın başarıyla mekanik strese maruz hücre kaynaklı nükleer deformasyonlar ve çalışma nükleer sertliği belirli bir çekirdek zarı proteinleri katkısını araştırmak için bize ve diğer gruplar tarafından kullanılmıştır. 4-8 Bu tekniğin avantajı, mekanik özellikleri probları çekirdekleri, normal hücresel ve hücre iskeleti çevre ve yaşam yüzey gerilme uygulama gibi, kas ve kan damarı duvarlarının müteahhitlik gibi b…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık (R01 HL082792 ve R01 NS059348) ve Brigham ve Kadın Hastanesi Kalp ve Damar Liderlik Grubu Ödülü Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Fibronectin | Millipore | FC010 |
| MitoTracker Red FM and Green FM | Invitrogen | M22425 and M-7514 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 |
| Hank’s Buffered Salt Saline | Invitrogen | 14185 |
| Phenol free, DMEM | Invitrogen | 21063 |
| Fetal bovine serum | Aleken Biologicals | FBSS500 |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P0781-100ML |
| Borosilicate Glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 |
| Gloss/Gloss non-reinforced silicone sheeting, 0.005″ | Specialty Manufacturing Inc. | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14200 |
| 35 mm glass bottom culture dishes (FluoroDish) | World Precision Instruments, INC | FD35-100 |
| Braycote 804 Vacuum Grease | Spi supplies | 05133A-AB |
References
- Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. Nuclear mechanics during cell migration. Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).
- Mejat, A., Misteli, T. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1, 40-52 (2010).
- Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy. J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).
- Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate. Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).
- Lammerding, J. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).
- Lammerding, J. Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells. J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).
- Lammerding, J. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
- Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors. Aging Cell. 7, 383-393 (2008).
- Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488, 459-469 (1995).
- Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure. Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).
