Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging
Summary
Eine Methode ist beschrieben, einzeln auswählen, bearbeiten und Bild zu leben Erreger mit einer optischen Falle gekoppelt an eine sich drehende Scheibe Mikroskop. Die optische Falle bietet räumliche und zeitliche Steuerung von Organismen und legt sie neben Wirtszellen. Fluoreszenzmikroskopie erfasst dynamische interzelluläre Wechselwirkungen mit minimaler Störung der Zellen.
Abstract
Dynamische Live Cell Imaging ermöglicht die direkte Visualisierung von Echtzeit-Interaktionen zwischen den Zellen des Immunsystems 1, 2, aber der Mangel an räumlicher und zeitlicher Steuerung zwischen den Fresszellen und Mikroben geleistet hat Beobachtungen in den ersten Interaktionen von Wirt Reaktion auf Krankheitserreger konzentrieren schwierig. Historisch gesehen haben interzellulären Kontakt Veranstaltungen wie Phagozytose 3 durch Mischen von zwei Zelltypen abgebildet worden, und dann kontinuierlich Scannen der field-of-view, um serendipitous interzellulären Kontakte auf der entsprechenden Stufe der Interaktion zu finden. Die stochastische Natur dieser Ereignisse macht dieses Verfahren langwierig, und es ist schwer zu früh oder flüchtige Ereignisse in Zell-Zell-Kontakt durch diesen Ansatz zu beobachten. Diese Methode erfordert finden Zellpaaren, dass am Rande der Kontakt sind, und beobachtet sie, bis sie vollendet ihre Kontaktdaten, oder nicht. Um diese Einschränkungen nutzen wir optische Fallen als nicht-invasive, nicht-destruktive, sondern eine schnelle und effektive Methode, um Zellen in Kultur positionieren.
Optische Fallen oder optische Pinzette, sind zunehmend in der biologischen Forschung eingesetzt, um zu erfassen und physisch zu manipulieren Zellen und anderen Mikrometergröße Teilchen in drei Dimensionen 4. Strahlungsdruck wurde zum ersten Mal beobachtet und auf optische Pinzette-Systeme in 1970 5, 6, und wurde zum ersten Mal verwendet werden, um biologische Proben im Jahr 1987 7 zu steuern. Seither haben optische Pinzette in eine Technologie ausgereift, um eine Vielzahl biologischer Phänomene 8-13 Sonde.
Wir beschreiben eine Methode, 14, die Fortschritte Live Cell Imaging durch die Integration einer optischen Falle mit Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie mit Temperatur und Luftfeuchtigkeit auf exquisite räumliche und zeitliche Steuerung von pathogenen Organismen in einer physiologischen Umgebung bieten, um Wechselwirkungen mit Wirtszellen, wie die ermittelten erleichtern Betreiber. Live, wurden pathogene Organismen wie Candida albicans und Aspergillus fumigatus, die tödlich enden, invasive Infektionen bei immungeschwächten Personen 15, 16 (z. B. AIDS, Chemotherapie und Organtransplantation Patienten) kann dazu führen, optisch gefangen mit zerstörungsfreien Laserintensitäten und zog neben Makrophagen, die den Erreger phagozytieren können. Hohe Auflösung, Durchlicht und Fluoreszenz-basierten Filmen etabliert die Fähigkeit zur frühen Ereignisse der Phagozytose in lebenden Zellen zu beobachten. Zur Demonstration der breiten Anwendbarkeit in der Immunologie, wurden primäre T-Zellen auch gefangen und manipuliert werden, um Synapsen mit anti-CD3 beschichteten Mikrokügelchen in vivo bilden und Zeitraffer-Bildgebung der Synapsenbildung wurde ebenfalls erhalten. Durch die Bereitstellung einer Methode, um feine räumliche Steuerung von Live-Erreger in Bezug auf Immunzellen ausüben können zelluläre Interaktionen mittels Fluoreszenzmikroskopie mit minimaler Störung von Zellen aufgenommen werden und können leistungsfähige Einblick in frühen Reaktionen der angeborenen und erworbenen Immunität zu erhalten.
Protocol
Discussion
In dieser Arbeit verwenden wir einen optischen Falle auf Krankheitserreger mit Abmessungen zwischen 3 um einzufangen – 5 pm. Obwohl Krankheitserreger von Interesse für unser Labor in der Regel diese Dimensionen haben, ist die optische Pinzette hier beschriebene System flexibel auf eine Vielzahl von Größen Falle. In der Tat optische Fallen wurden verwendet, um Partikel von einzelnen Atomen, Zellen etwa 10 um im Durchmesser erfassen. Zusätzlich wurde diese optische Fallen System in der Lage, Partikel in verschiedenen …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Massachusetts General Hospital Department of Medicine Internal Funds (JMT, MKM, MLC, JMV), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering gewähren T32EB006348 (CEC), Massachusetts General Hospital Center for Computational and Integrative Biology Fonds für die Entwicklung und AI062773 unterstützt ( RJH), Zuschüsse AI062773, DK83756 und DK 043351 (RJX), NSF 0643745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL) und National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) der National Institutes of Health (NIH) AI057999 (JMV ). Wir danken Nicholas C. Yoder für hilfreiche Diskussionen und Charles Filze (RPI, Inc.) für die technische Unterstützung.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| A. fumigatus | Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
| Fresh blood | Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS | ||
| Nikon inverted microscope | Nikon | Model Ti-E | |
| Trapping laser, ChromaLase | Blue Sky Research | CLAS-106-STF02-02 | |
| Fluorescence excitation laser | Coherent | Model Innova 70C | |
| Breadboards for trapping components | Thorlabs | MB1224, MB1218 | |
| Optical air table | Technical Manufacturing Corporation | ||
| Electronic shutter with pedal control | Uniblitz | Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY | |
| Singlemode optical fiber | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Fiber positioner | Thorlabs | PAF-X-5-C | |
| Fiber collimator | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Lenses for telescope | Thorlabs | AC254-150-B | Focal length of 150 mm |
| Translation stages (x, y, z) | Newport | M-461-XYZ | |
| IR dichroic mirror | Chroma | ET750-sp-2p8 | |
| Objective lens (100X) | Nikon | NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective | |
| Confocal head | Yokogawa | CSU-XI | |
| Polarizer | Nikon | MEN51941 | |
| Wollaston prism | Nikon | MBH76190 | |
| EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| CCD camera (ORCA ER) | Hamamatsu | C4742-80-12AG | |
| Filter wheel | Ludl | 99A353 | |
| Filter wheel | Sutter | LB10-NWE | |
| Chambered coverglass | Lab-Tek/Nunc | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Coated with anti-CD3 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen/Gibco | 10313 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum (HyClone) | ThermoScientific | SH30071.03 |
References
- Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).
- Ashkin, A. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).
- Ashkin, A., Dziedzic, J. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science. Nature. 235, 1517-1520 (1987).
- Khalil, A. S. Single M13 bacteriophage tethering and stretching. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).
- Khalil, A. S. Kinesin’s cover-neck bundle folds forward to generate force. Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).
- Li, Z. Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers. Biophys J. , 1386-1395 (2002).
- Kim, S. The αβ T cell receptor is an anisotropic mechanosensor. J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).
- Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers. Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).
- Tam, J. Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions. PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature. Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).
- Wey, S. B. Hospital-acquired candidemia – the attributable mortality and excess length of stay. Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).
