תת עורי מינהל היריבים Muscarinic ו Triple-Immunostaining של השריר Levator Longus Auris של עכברים
Summary
אנו מתארים נהלים לניהול חוזרות ונשנות של מעכבי איתות muscarinic כדי longus levator auris (LAL) השרירים של עכברים בוגרים צעירים עבור immunostaining הבאות של צמתים neuromuscular שלה (NMJs) ב wholemounts. השריר LAL יש יתרונות ייחודיים עבור חושף<em> In vivo</em> השפעות פרמקולוגיות על NMJs.
Abstract
שרירי הגפיים האחוריות של מכרסמים, כגון הגסטרוקנמיוס ו tibialis הקדמי, משמשים לעתים קרובות במחקרים פרמקולוגיים vivo של אותות חיוני ליצירת ותחזוקה של NMJs יונקים. עם זאת, חדירת התרופה לתוך השרירים הללו לאחר תת עורית או תוך שרירית הממשל היא לעתים קרובות לא שלם או אחיד NMJs רבים יכולים נותרות בעינן. אמנם הממשל מערכתית עם מכשירים כגון מיני משאבות יכולים לשפר את ההשפעות spatiotemporal, אופי פולשני של גישה זו עלולה לגרום תגובות דלקתיות בלבול ו / או נזק לשרירים ישיר. יתר על כן, ניתוח מלא של NMJs בשריר הגפיים האחוריות הוא מאתגר, מכיוון שהיא דורשת זמן רב חתך סדרתי immunostaining נרחב.
LAL העכבר הוא סדין דק, שטוח של שריר הממוקם על שטחי dorsum של הצוואר. הוא עווית שריר מהיר שמתפקד להעביר את פינה. הוא מכיל חלקים מקורי ואת הזנב שמקורם קו האמצע של הגולגולת ולהרחיב רוחבית לחלק סחוסי של כל פינה. השריר מסופק על ידי ענף של עצב הפנים כי פרויקטים caudally מיד עם יציאתו foramen stylomastoid. אנו ואחרים מצאו LAL להיות הכנה נוח כי יתרונות לחקירת הן קצרות וארוכות טווח vivo השפעות של תרופות על NMJs והשרירים. ראשית, המיקום שלה שטחית מקלה יישומים מקומיים רבים של תרופות תחת הרדמה קלה. שנית, הרזון שלה (2-3 שכבות של סיבי שריר) היתרי להדמיה וניתוח של כמעט כל NMJs בתוך השריר. שלישית, את קלות לנתח את זה עם שלם העצב שלה יחד עם דפוס של העצבוב שלו מאפשר ניתוח משלים אלקטרו במבחנה 9,5. לאחרונה, ואולי הכי חשוב, נפח להחיל קטן (~ 50μl) בקלות מכסה את פני השטח כולו שרירים, ומספק חשיפה אחידה וממושכת של כל NMJs שלה לתרופה מבטלת את הצורך בגישה מערכתית 1,8.
Protocol
Discussion
השיטה המוצגת כאן היתרי חקירה של תפקידים מוכרים בעבר של mAChR-תת ספציפיים איתות ביציבות ותחזוקה של NMJs יונקים. שיטה זו תהיה גם שימושית כדי לבדוק את ההשפעות של גורמים neurotrophic וסוכני תרופתי. לדוגמה, המעבדה שלנו מצאו כי פקטור neurotrophic ריסי (CNTF) שהושרו מבצבצות כמעט כל מסופי LAL העצ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי ניוון שרירים האגודה, NIH (NS062320).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| ketamine | Hospira | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd Laboratories | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg – 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 – 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M – 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M – 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
References
- Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
- Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).
- Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).
- Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses. J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
- Lanuza, M. A. Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase. C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).
- Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
- Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
- Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
- Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
- Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).
