Muscarinic गरम के चमड़े के नीचे प्रशासन और Levator AURIS Longus बलवान चूहे में ट्रिपल Immunostaining
Summary
हम दोहराया muscarinic संकेतन के inhibitors के levator AURIS (लाल) longus युवा वयस्क चूहों की मांसपेशियों के लिए प्रशासन के लिए और अपने neuromuscular जंक्शनों के बाद wholemounts में (NMJs) immunostaining के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन. लाल मांसपेशी खुलासा करने के लिए अद्वितीय फायदे हैं<em> Vivo में</em> NMJs पर औषधीय प्रभाव है.
Abstract
Gastrocnemius और tibialis पूर्वकाल जैसे कृन्तकों, हिंद अंग मांसपेशियों अक्सर स्तनधारी NMJs के गठन और रखरखाव के लिए आवश्यक संकेतों के vivo में औषधीय अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है. हालांकि, इन मांसपेशियों में चमड़े के नीचे या इंट्रामस्क्युलर प्रशासन के बाद दवा पैठ अक्सर अधूरी है या असमान और कई NMJs अप्रभावित रह सकता है. हालांकि मिनी पंप के रूप में इस तरह के उपकरणों के साथ प्रणालीगत प्रशासन spatiotemporal प्रभाव में सुधार कर सकते हैं, इस दृष्टिकोण का आक्रामक स्वभाव confounding भड़काऊ प्रतिक्रियाओं और / या प्रत्यक्ष मांसपेशियों की क्षति पैदा कर सकता है. इसके अलावा, पिछले अंग मांसपेशियों में NMJs का पूरा विश्लेषण चुनौती दे रहा है क्योंकि यह समय लेने वाली धारावाहिक सेक्शनिंग और व्यापक immunostaining की आवश्यकता है.
माउस लाल मांसपेशियों की एक पतली, फ्लैट शीट पर गर्दन के dorsum अल्पज्ञता स्थित है. यह एक तेजी से चिकोटी मांसपेशियों है कि कार्यों सुफ़ना स्थानांतरित करने के लिए. यह कि cranium के midline से उत्पन्न और प्रत्येक सुफ़ना की नरम हड्डी भाग के लिए laterally विस्तार व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम भाग होते हैं. मांसपेशियों चेहरे तंत्रिका कि यह stylomastoid रंध्र से बाहर निकालता है के रूप में caudally परियोजनाओं की एक शाखा के द्वारा आपूर्ति की है. हम और दूसरों के लिए एक सुविधाजनक तैयारी है कि NMJs और मांसपेशियों पर दवाओं के vivo प्रभाव में दोनों छोटी और लंबी अवधि की जांच के लिए लाभ प्रदान करता है लाल पाया है. सबसे पहले, अपने सतही स्थान प्रकाश संज्ञाहरण के तहत दवाओं के कई स्थानीय अनुप्रयोगों की सुविधा है. दूसरा, इसके thinness (मांसपेशी फाइबर के 2-3 परतों) और मांसपेशियों के भीतर लगभग सभी NMJs के दृश्य विश्लेषण परमिट. तीसरा, यह इसकी तंत्रिका बरकरार साथ अपने innervation के पैटर्न के साथ एक साथ विदारक आसानी 9,5 इन विट्रो में पूरक electrophysiological विश्लेषण परमिट . अंतिम है, और शायद सबसे महत्वपूर्ण बात, एक छोटे से लागू मात्रा (~ 50μl) आसानी से पूरे मांसपेशियों की सतह को कवर, एक समान और लंबे समय तक अपने सभी NMJs की दवा के लिए जोखिम प्रदान करता है और एक प्रणालीगत 1,8 दृष्टिकोण के लिए की आवश्यकता eliminates.
Protocol
Discussion
यहाँ प्रस्तुत विधि subtype विशेष स्तनधारी NMJs की स्थिरता और रखरखाव में संकेत mAChR के पहले से अपरिचित भूमिका की जांच परमिट. इस विधि भी उपयोगी हो neurotrophic कारकों और औषधीय एजेंटों के प्रभाव का परीक्षण करेंगे. उदाहरण क?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम पेशी Dystrophy एसोसिएशन, एनआईएच, (NS062320) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| ketamine | Hospira | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd Laboratories | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg – 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 – 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M – 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M – 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
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