이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum</em
Summary
여기, 우리는 chemotaxis를 조사에 대한 자세한 라이브 셀 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 마이 그 레이션 세포에서 이벤트를 신호의 spatiotemporal 역학을 모니터 형광 현미경 방법을 제시한다. 신호 이벤트의 측정은 더욱 GPCR – 신호 네트워크 chemoattractants 및 제어 진핵 세포의 방향 이주 감지 기울기를 달성 방법을 이해하기 위해 우리를 허용합니다.
Abstract
대부분의 진핵세포 세포는 자신의 환경에서 화학적 신호의 기울기를 감지하고 이에 따라 1 마이그레이션할 수 있습니다. 이 가이드 셀 마이 그 레이션은 이러한 세포의 연결 2, 3의 면역 세포와 patterning의 인신 매매는 그들의 기능을 수행하는 다양한 세포에 필수적인 것입니다 chemotaxis로라고합니다. G – 단백질 결합 수용체의 큰 가족 (GPCRs)는 생체내 4 셀 마이 그 레이션을 직접하기 위해 chemokines로 알려진 변수 작은 펩티드를 감지합니다. chemotaxis 연구의 최종 목표는 GPCR 기계 감각의 케모카인 그라디언트와 컨트롤 chemotaxis에 선도적인 이벤트를 신호 방법을 이해하는 것입니다. 이를 위해, 우리는 실시간으로, chemoattractant의 그라데이션에 chemoattractants, 세포 운동의 spatiotemporal 농도를 모니터링하는 이미징 기술을 사용, GPCR은 heterotrimeric G – 단백질의 활성화를 중재하고, 5-8 진핵 세포의 chemotaxis에 관련된 세포내 신호 이벤트 . 간단한 진핵 생물, Dictyostelium의 discoideum은 leukocytes의 것과 유사 chemotaxic 동작을 표시하고, D. discoideum는 진핵세포 chemotaxis를 공부에 대한 핵심적인 모델 시스템입니다. 자유 생활 amoebae, D.으로 discoideum 세포가 풍부한 매체 나눕니다. 기아되면 세포들은 multicullular 구조를 형성 CAMP – 중재 chemotaxis를 통해 집계되는 발달 프로그램을 입력합니다. 캠프 chemotaxis에 관련된 대부분의 구성 요소 D.으로 확인되었습니다 discoideum. GPCR에 캠프의 바인딩 (cAR1)는 Gγ 및 Gβγ의 subunits 7, 9, 10로 heterotrimeric의 분리 G – 단백질을 유도. Gβγ subunits는 회전 활성화의 PI3K에서, 세포막 11-13에 PIP 3에 PIP 2 변환 RAS를 활성화해야합니다. PIP 3 따라서 멤브레인 14, 15 이러한 단백질을 모집, pleckstrin의 상동 (PH) 도메인과 단백질에 대한 구속력이 사이트의 역할을합니다. cAR1 수용체의 활성화는 또한 PIP 2 16, 17 PIP 3 dephosphorylates PTEN의 멤브레인 연결을 제어합니다. 분자 메커니즘은 evolutionarily 같은 neutrophils 18 인간 세포의 케모카인 GPCR – 중재 chemotaxis에 보존되어있다. 우리는 D.의 chemotaxis를 공부에 대한 다음과 같은 방법을 제시 discoideum 세포. 1. chemotactic 컴포넌트 세포의 준비. 2. 캠프 기울기에 세포의 영상이 chemotaxis. 3. 한 살 세포에서 G – 단백질 heterotrimeric의 GPCR 유도된 활성화를 모니터링. 4. 실시간으로 한 라이브 세포 이미징 chemoattractant – 트리거 다이나믹 PIP 3 응답. 우리 개발한 이미징 방법은 인간 leukocytes의 chemotaxis을 연구에 적용할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
세포의 chemotactic 관할 단계에 도달하는 과정
야생 유형 D. discoideum 세포, 그건 소요 약 5 세포가 잘 편광 세포 형태학 및 신속한 세포 마이 그 레이션 (그림 1)을 표시하는 동안 잘 chemotactic 관할 무대로 그들을 유도하기 위해 상온에서 개발을 pulsing ~ 6 시간. 이러한 pulsing, 온도 및 다른 유전 배경에 대한 캠프 농도 등 여러 가지 요인은, chemotactic 유능한 단계에 도달하는 과정…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIAID, NIH에서 교내 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| D3-T Growth Media | KD Medical | ||
| Caffeine | Sigma | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes | ||
| cAMP | Sigma | ||
| ChronTrol XT programmable timer | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 peristaltic pump | Gilbson | ||
| Platform rotary shaker | |||
| FemtoJet microcapillary pressure supply | Eppendorf | ||
| Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International | ||
| LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope | Zeiss | a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | |
| Olympus X81 or equivalent | Olympus | Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens |
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