Vivo में लिवर लिवर छिड़काव द्वारा लिवर कोशिकाओं के शोधन द्वारा पीछा किया endocytosis
Summary
जिगर sinusoidal endothelial कोशिकाओं (सेकेंड) के अध्ययन के प्राथमिक पशु से प्राप्त के रूप में कोई सेल लाइनों मौजूद कोशिकाओं के साथ किया जाना चाहिए. यह जिगर और बाद संवर्धन और प्रयोग के लिए एसईसी शुद्धि के लिए अंतर है centrifugation पाचन विधि पर निर्भर करता है है.
Abstract
The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (˜100 μm) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.
Protocol
Discussion
फांसी ड्रॉप विधि जिसमें isoflurane वाष्प लाती बेहोशी हमारे अध्ययन के लिए पसंदीदा तरीका है द्वारा चूहे की संज्ञाहरण. एक vaporizer भी चैम्बर के बाहर जानवरों को बनाए रखने के लिए कपास के साथ एक सिरिंज के बजाय हो सकता है इस्तेमाल किया जा है, लेकिन शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं इतनी जल्दी, यह आवश्यक नहीं है. Polyethylene glycol isoflurane करने के लिए जोड़ा जाता है वाष्प दबाव और वाष्पीकरण की दर में कमी. बहुत isoflurane वाष्प की मौत भी जल्दी प्रेरित करेगा. यदि पशु मर जाता से पहले जिगर और cannulated टीबीएस, जिगर में pooling खून कर सकते हैं थक्का साथ blanched और collagenase साथ sinusoids और पाचन के कुशल धोने को रोकने. हेपरिन के अलावा एक anticoagulant के रूप में उपयोगी हो सकता है, लेकिन प्रयोग किया जाता है के बाद से हम अपनी जांच के रूप में लेबल हेपरिन का उपयोग इन अध्ययनों में नहीं हो सकता है.
एक बड़ी सीमा तक बफर नमकीन घोल (GBSS) अक्सर सेकेंड की शुद्धि के लिए अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा प्रतिस्थापित. हालांकि यह एसईसी शुद्धि, hep के लिए उपयोगी हैatocytes के रूप में के रूप में अच्छी तरह से GBSS Buffers 1-3 बर्दाश्त नहीं और viabilities लगभग के रूप में उच्च नहीं कर रहे हैं. जब endocytosis को मापने, यह अंग में और hepatocytes शुद्ध में पृष्ठभूमि के स्तर को मापने के लिए अच्छा अभ्यास है.
इस विधि collagenase साथ जिगर छिड़काव के बाद सेकेंड के कुशल शुद्धि के लिए दो में से एक है. अन्य विधि धावन 19 centrifugation के बजाय Percoll ढाल द्वारा गैर parenchymal कोशिकाओं को अलग . Percoll gradients पर धावन का उपयोग करने के लिए लाभ से थोड़ा अधिक सेल viabilities और संख्या हैं. नकारात्मक पक्ष यह है कि धावन centrifugation एक विशेष रोटर, समर्पित अपकेंद्रित्र, और क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला साथ पंप है जो डॉलर के हजारों के दसियों की लागत की आवश्यकता है. इस विधि केवल एक प्रशीतित तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र और क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप जो कई प्रयोगशालाओं में मानक के उपयोग की आवश्यकता है.
चयनात्मक आसंजन सेकेंड और KCS के पृथक्करण एक मानक पद्धति है20-22. हालांकि यह सच है कि सेकेंड कांच और प्लास्टिक का पालन करना होगा, प्रमुख बिंदु के लिए एक 15 मिनट ऊष्मायन से अधिक नहीं के साथ 37 पर एसिड धोया साफ कांच का उपयोग ° सी 5% से कम सीओ 2. KCS हमेशा सेकेंड की तुलना में तेजी से पालन करेंगे और यह धीरे मीडिया के साथ KCS को धोने के लिए किसी भी शेष सेकेंड कि शिथिल संलग्न हो गए हैं निकालने की सलाह दी जाती है. Pronase और अन्य proteases भी इस प्रोटोकॉल में collagenase पाचन कदम से छोड़े गए कक्षों की वृद्धि viabilities. Proteases कोशिकी रिसेप्टर्स को पचाने और अंतिम शोधन चरणों में सेलुलर आसंजन को बाधित कर सकते हैं.
विधि यहाँ प्रस्तुत आवेदनों की एक विस्तृत विविधता है. हालांकि हम अंतिम परिणाम में जो हेपरिन शुरू में मंजूरी प्राथमिक hepatocytes प्राप्त करने के लिए, जिगर के छिड़काव के लिए लिया जाता है दिखाने के लिए, के.सी., सेकेंड, और HSCs चयापचय रास्ते, immunoregulation, मेहतर गतिविधियों, और अन्य शामिल अध्ययन का एक नंबर के लिए उपयोगी हो सकता है शारीरिक Studiतों. इस प्रक्रिया का सबसे कठिन हिस्सा पोर्टल शिरा से कैथेटर पर्ची के बिना अच्छा केन्युलेशन, जिगर की पाचन, और जिगर की हैंडलिंग है.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Univ पर डॉ. पॉल Weigel धन्यवाद देना चाहूंगा. HARE/Stabilin-2 और उसे तकनीकी सहायता के लिए रिसेप्टर जेनेट Weigel का पता लगाने के के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 30 के उपयोग के लिए ओकलाहोमा के. इस शोध विश्वविद्यालय नेब्रास्का रिसर्च फंड के द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
- Buffer 1: 142 mM NaCl 6.7 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.5% BSA, pH 7.4
- Buffer 2 (perfusion buffer): 67.0 mM NaCl, 6.7 mM KCl, 4.8 mM CaCl2-H2O, 101.0 mM HEPES, BSA 1.5%, pH 7.4.
- Buffer 3: 137 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0.7 mM MgSO4, 1.2 mM CaCl2-2H2O, 10 mM HEPES, 1.5% BSA, pH 7.4
- RPMI/BSA: 15g/L BSA in RPMI
- TRIS-buffered Saline (TBS): 154 mM NaCl, 10 mM Trizma Base salt.
- Collagenase: Collagenase A (#11088785103) from Roche, Collagenase Type I (#LS004691) from Worthington Biochemical or Collagenase I (#C0130) or IA (#C9891) from Sigma-Aldrich.
All salts are from Sigma-Aldrich
| Name | Company | Model/catalog # | Comment |
| 20L water bath | ThermoFisher | 2231 | Water is about 45°C to compensate for cooling within the tubing. |
| Peristaltic Pump | Cole-Parmer | 7553-70 | Masterflex series |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend XTR | |
| Catheter | BD Biosciences | 381444 | |
| Dessicator chamber | Fisher | 08595E | Use internal plate |
| Percoll | Sigma | P4937 | |
| Bovine Serum Albumin | SeraCare | AP-4510-01 | |
| 100 μm mesh | Spectrum labs | 146488 | |
| 30 μm mesh | Spectrum labs | 146506 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
| Polyethylene glycol | Spectrum labs | PO107 |
References
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