Studien av levern sinusformad endotelceller (sek) måste utföras med primära celler från djuret som inget cellinjer finns. Denna metod förlitar sig på levern matsmältningen och differentierad centrifugering för SEC rening för efterföljande odling och experimenterande.
Levern är den metaboliska centrum av däggdjur kroppen och fungerar som ett filter för blodet. Den grundläggande strukturen av levern illustreras i figur 1 där mer än 85% av levern massa består av hepatocyter och resterande 15% av den cellulära massan består av Kupfferceller (KCS), stellate celler (HSCs), och sinusformad endotelceller (sek). SECS bildar blodkärlens väggar i levern och innehåller speciella morfologi kallas fenestrae inom i cytoplasman. Fasadentreprenör av cytoplasman är uppkomsten av hål (~ 100 mikrometer) i cellerna så att SECS fungerar som ett såll där de flesta kylomikroner, rester chylomicron och makromolekyler, men inte celler, passera till hepatocyter och HSCs 1 (Fig. 1). På grund av avsaknaden av en källare membran, gapet mellan sekunder och hepatocyter utgör område för spridning och annan. HSCs ockupera detta utrymme och spela en framträdande roll i reglering och svar jagnjury, lagring av retinoinsyra och immunoregulation i levern 2.
SECS är bland de mest endocytically aktiva celler i kroppen som visar en rad renhållare receptorer på cellens yta 3. Dessa inkluderar SR-A, Stabilin-1 och Stabilin-2. Generellt är små kolloidala partiklar mindre än 230 nm och makromolekyler i buffert fas tas upp av Sek, medan stora partiklar och cellulära skräp endocyteras (fagocyteras) genom att KCS 4. Således är huvuddelen clearance av extracellulärt material såsom glykosaminoglykaner från blodet till stor del beroende på hälsa och endocytic funktioner SECS 5,6. Till exempel är en ökning i blodet hyaluronan nivåer tecken på leversjukdom, från lätt till svårare former 7.
Med undantag av en rapport 8, det finns inga förevigade SEC cellinjer som finns. Även denna förevigat cellinje är de-difreras i att det inte uttrycker renhållare receptorer som finns på primära sek (våra data, visas inte). Alla cellbiologiska studier måste utföras på galvaniska element erhålls friskt från djuret. Tyvärr SECS dedifferentiate under normala odlingsförhållanden och måste användas inom 1 eller 2 dagar efter isolering från djuret. Differentiering av SECS präglas av ett uttryck för Stabilin-2 eller hare receptorn 9, CD31, och närvaron av cytoplasmisk fenestration 1. Differentiering av SECS kan förlängas genom tillsats av VEGF i kultur media eller genom odling av celler i hepatocyte betingad medelstora 10,11.
I denna rapport kommer vi att visa endocytic aktivitet SECS i intakta orgeln med radioaktivt märkt heparin för hyaluronan för SEC-specifika Stabilin-2 receptorn. Vi kommer då att rena hepatocyter och SECS från perfusion levern att mäta endocytos.
Anestesi av råtta med droppe metod där isofluran ånga framkallar medvetslöshet är den bästa metoden för våra studier. En förgasare kan också användas i stället för en spruta med bomull för att hålla djuret utanför kammaren, men kirurgiska ingrepp är så snabb, att det inte behövs. Polyetylenglykol läggs till isofluran för att minska ångtryck och avdunstningen. För mycket isofluran ångan kommer att leda till döden för snabbt. Om djuret dör innan levern är kanylerade och skållade med TBS, samla blod kan koagulera i levern och förhindra effektiv tvättning av sinusoider och matsmältning med kollagenas. Tillsatsen av heparin kan vara användbara som antikoagulantia men används inte i dessa studier eftersom vi använder heter heparin som vår sond.
Gey är buffrad saltlösning (GBSS) är ofta ersätts med andra laboratorier för rening av sekunder. Även om det är användbart för SEC rening, Hepatocytes tolererar inte GBSS samt Buffertar 1-3 och viabilitet är inte alls lika hög. Vid mätning av endocytos, är det god sed att mäta bakgrundsnivåerna i orgeln och i renat hepatocyter.
Denna metod är en av två för effektiv rening av SECS efter levern perfusion med kollagenas. Den andra metoden skiljer icke-parenkymceller av elutriation centrifugering 19 istället för Percoll lutning. Fördelarna att använda elutriation över Percoll lutningar är något högre cell viabilitet och siffror. Nackdelen är att elutriation centrifugering kräver en specialiserad rotor, dedikerad centrifug och Slangpumpar tillsammans som kostar tiotusentals dollar. Denna metod kräver endast användning av en kyld bordsskiva centrifug och peristaltiska pump som är standard i många laboratorier.
Separation av sekunder och KCS genom selektiv vidhäftning är en standardmetod20-22. Även om det är sant att SECS kommer att följa glas och plast, är nyckeln som ska användas syratvättad rent glas med högst 15 minuters inkubation vid 37 ° C vid 5% CO 2. KCS kommer alltid att hålla sig snabbare än sekunder och det är lämpligt att försiktigt tvätta KCS med media för att hämta eventuella kvarvarande SECS som blivit löst bifogad. Pronase och andra proteaser är också utelämnats i stegen kollagenas matsmältningen i detta protokoll för att öka viabilitet av cellerna. Proteaser smälta extracellulära receptorer och kan hämma cellulär adhesion i sista reningssteg.
Den metod som presenteras här har en mängd olika tillämpningar. Även om vi visar slutresultatet som heparin initialt tas upp för godkännande, perfusion av levern för att erhålla primära hepatocyter, kan KC, Sek, och HSCs vara användbart för ett antal studier med metaboliska vägar, immunoregulation, aktiviteter asätare, och andra fysiologiska StudiES. Den svåraste delen av detta förfarande är bra kanylering, nedbrytning av levern, och hantering av levern utan att ha katetern glida från portalen ven.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr Paul Weigel vid Univ.. i Oklahoma för användning av monoklonala antikroppar 30 för detektion av HARE/Stabilin-2 receptorn och Janet Weigel för henne tekniskt bistånd. Denna forskning finansieras av University of Nebraska forskningsmedel.
All salts are from Sigma-Aldrich
Name | Company | Model/catalog # | Comment |
20L water bath | ThermoFisher | 2231 | Water is about 45°C to compensate for cooling within the tubing. |
Peristaltic Pump | Cole-Parmer | 7553-70 | Masterflex series |
Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend XTR | |
Catheter | BD Biosciences | 381444 | |
Dessicator chamber | Fisher | 08595E | Use internal plate |
Percoll | Sigma | P4937 | |
Bovine Serum Albumin | SeraCare | AP-4510-01 | |
100 μm mesh | Spectrum labs | 146488 | |
30 μm mesh | Spectrum labs | 146506 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
Polyethylene glycol | Spectrum labs | PO107 |