Nous décrivons un protocole pour identifier les rôles clés des molécules de l'hôte de signalisation dans la réplication lytique d'un virus de l'herpès modèle, gamma herpèsvirus 68 (γHV68). L'utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées et des fibroblastes embryonnaires de γHV68 réplication lytique, le protocole permet à la fois la caractérisation phénotypique et moléculaire de l'interrogatoire interactions virus-hôte dans la réplication virale lytique.
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Article de méthode
Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d'un virus de l'herpès modèle
Dans cet article
Résumé
Résumé
En réponse à une infection virale, une foule se développe diverses réactions défensives, telles que l'activation de l'immunité innée voies de signalisation qui conduisent à la production de cytokines 1,2 antiviral. Afin de coloniser l'hôte, les virus sont obligatoire pour échapper réponses de l'hôte antiviraux et de manipuler des voies de signalisation. Démêler l'interaction hôte-virus fera la lumière sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre l'infection virale.
ΓHV68 murin est étroitement liée à oncogène humain sarcome de Kaposi associé au virus de l'herpès et Epsten-Barr 3,4. γHV68 infection chez les souris de laboratoire fournit un modèle animal docile petite pour examiner toute la durée de réponse de l'hôte et l'infection virale in vivo, qui ne sont pas disponibles pour les herpèsvirus humains. Dans ce protocole, nous vous présentons un panel de méthodes de caractérisation phénotypique et dissection moléculaire des composants de l'hôte de signalisation dans γHV68 replic lytiquetion à la fois in vivo et ex vivo. La disponibilité de souches de souris génétiquement modifiées permet l'interrogation des rôles des voies de signalisation hôtes pendant γHV68 infection aiguë in vivo. En outre, des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) isolés à partir de ces souches de souris déficientes peut en outre être utilisé pour décortiquer les rôles de ces molécules in vivo au cours de γHV68 réplication lytique ex.
En utilisant des tests de biologie moléculaire et virologiques, nous pouvons identifier le mécanisme moléculaire de interactions hôte-virus et d'identifier l'hôte et des gènes viraux essentiels à la réplication virale lytique. Enfin, un chromosome artificiel bactérien (BAC) système facilite l'introduction de mutations dans le facteur viral (s) spécifiquement interrompre l'interaction hôte-virus. ΓHV68 recombinant portant ces mutations peuvent être utilisés pour récapituler les phénotypes de γHV68 réplication lytique dans les MEF déficientes en clé d'hôte de signalisation composants.Ce protocole offre une excellente stratégie pour interroger interaction hôte-pathogène à de multiples niveaux d'intervention in vivo et ex vivo.
Récemment, nous avons découvert que γHV68 usurpe une voie de signalisation immunitaire inné pour promouvoir la réplication virale lytique 5. Plus précisément, γHV68 infection de novo active la kinase IKKβ immunitaire et IKKβ activée phosphoryle le facteur de transcription virale maître, de réplication et de transactivateur (RTA), afin de promouvoir virale activation de la transcription. Ce faisant, γHV68 efficacement son activation transcriptionnelle couples d'accueillir l'activation immunitaire innée, ce qui facilite la transcription virale et la réplication lytique. Cette étude fournit un excellent exemple de ce que peut être appliqué à d'autres virus d'interroger les interactions hôte-virus.
Protocole
1. L'infection de souris avec γHV68
- Souris même portée de six à huit semaines vieux, genre assortie (8 à 12 souris / groupe) sont utilisés pour l'infection virale. Permettez-souris pour s'acclimater pendant quatre jours complets (96 heures) après l'expédition.
- Étapes du protocole à l'aide de virus doit être effectué dans un cabinet de biosécurité de niveau 2 (BSL2) en utilisant des BSL2 précautions.
- Préparer une suspension virale (40 à 1 x 10 5 unités formant des plages [UFP]) de γHV68 dans 30 ul de PBS stérile par souris juste avant l'expérience. Gardez suspension virale sur la glace.
- Préparer la solution de kétami....
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Discussion
En réponse à une infection virale, les Mavs dépendantes immunitaires innées des voies de signalisation sont activés pour promouvoir la production de cytokines inflammatoires antiviraux 10-14. Utilisation γHV68 murin comme un virus oncogène humain modèle pour le sarcome de Kaposi associé au virus de l'herpès et le virus d'Epstein-Barr 3,4, nous avons découvert que γHV68 usurpe la voie MAVS-IKKβ de promouvoir la réplication virale lytique via l'activation de la transcription 5........
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr James (Zhijian) Chen (UT Southwestern, biologie moléculaire) pour fournir des réactifs essentiels, y compris les Mavs - / - souris, et le Dr Ren Sun (Université de Californie-Los Angeles, pharmacologie et de médecine moléculaire ) pour fournir le chromosome bactérien artificiel de γHV68 pour cette étude.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Electro-MAX cellules DH10B compétentes | Invitrogen | 18290-015 | |
| Méthylcellulose | Sigma | M0512 | |
| POWERPREP HP plasmide système Miniprep | OriGene | NP100004 | |
| POWERPREP HP plasmide système Midiprep | OriGene | NP100006 |
Références
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449, 819-826 (2007).
- Speck, S. H., Virgin, H. W.
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Réimpressions et autorisations
