تم وصف مولد الرمع مقايسة ثلاثية الأبعاد التي تسمح البنكرياس مثل الأسلاف على التمايز إلى المستعمرات معربا عن الانسولين. هذا الأسلوب يستفيد من شبه صلبة تحتوي على وسائل الاعلام methylcellulose ، Matrigel وعوامل النمو ، والتي تتكاثر والأسلاف واحد يفرق<em> في المختبر</em> ، والسماح الكمي لعدد من الأسلاف وظيفية في عدد السكان.
وقد أعاق مجال الجذعية البنكرياس والسلف بيولوجيا الخلية بسبب نقص في المختبر المقايسات الفنية والكمية التي تسمح للتحليل خلية واحدة. تحليلات الأسلاف واحدة هي ذات أهمية حاسمة لأنها توفر سبل نهائي لإثبات بشكل قاطع احتمال نسب أسلاف الفردية. على الرغم من أن وضعت وسائل لتوليد "pancreatospheres" في الثقافة تعليق من الخلايا واحدة ، وجود عدة قيود. الأول ، هو تستغرق وقتا طويلا لتنفيذ واحد ترسب الخلايا لعدد كبير من الخلايا ، والتي بدورها الأوامر كميات كبيرة من وسائل الإعلام والثقافة ، والفضاء. الثانية ، ترقيم pancreatospheres الناتج كثيفة العمالة ، وخصوصا عندما تردد الأسلاف pancreatosphere – الشروع منخفضة. الثالث ، ومقايسة pancreatosphere ليس وسيلة فعالة للسماح كلا من الانتشار والتفريق بين الأسلاف البنكرياس في الثقافة نفسها بشكل جيد ، وإعادةstricting فائدة الفحص.
للتغلب على هذه القيود ، وقد تم وضع شبه صلبة وسائل الاعلام القائمة على مقايسة مستعمرة الأسلاف البنكرياس ويرد في هذا التقرير. هذا الأسلوب يستفيد من مفهوم موجود من مقايسة مستعمرة المكونة للدم ، والذي يستخدم لتوفير methylcellulose اللزوجة إلى وسائل الإعلام ، والسماح للخلايا الاصلية في البقاء في الفضاء الثلاثي الأبعاد كما أنها تخضع الانتشار فضلا عن التمايز. لإثراء الانسولين معربا عن تشكيل مستعمرة الأسلاف من السكان غير متجانسة ، ونحن نعرب عن الخلايا التي استخدمت neurogenin (NGN) 3 ، والسلف البنكرياس الصماء علامة الخلية. الفئران الجذعية الجنينية (ES) الخلايا المشتقة من الخلايا معربا عن Ngn3 المفتاحية المعززة الأخضر مراسل بروتين فلوري تم فرزها وما يصل الى 25000 في الخلايا وكذلك في المرفق مطلية منخفضة 24 الأطباق الثقافة أيضا. اجتمع : كل الواردة من 500 ميكرولتر من شبه صلبة وسائل الاعلام مع المكونات الرئيسية التاليةhylcellulose ، Matrigel ، نيكوتيناميد ، exendin – 4 ، βB activin ، ووسائل الإعلام المكيفة التي تم جمعها من الفئران الخلايا المشتقة من خلية البنكرياس مثل وفاق. بعد 8 إلى 12 يوما للثقافة ، معربا عن الانسولين مع المستعمرات مميزة تشكلت مورفولوجيا ويمكن لمزيد من التحليل للتعبير الجين البنكرياس باستخدام كمية RT – PCR وتلطيخ immunoflourescent لتحديد تكوين نسب كل مستعمرة.
باختصار ، لدينا تجربة مستعمرة يسمح السهل الكشف النوعي والكمي لأسلاف ظيفية ضمن مجموعة من السكان غير متجانسة من الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، شكل وسائل الاعلام شبه صلبة تتيح عرض موحد لمكونات المصفوفة خارج الخلية ، وعوامل نمو الخلايا ، مما الأسلاف لتتكاثر والتفريق في المختبر. هذا الاختبار مستعمرة يوفر فرصا فريدة للدراسات الميكانيكية للخلايا البنكرياس السلف على مستوى خلية واحدة.
واقتصرت مستعمرة المقايسات التي تسمح التقييمات الكمية والفنية للأسلاف البنكرياس الفردية حتى الآن ، مما أعاق كثيرا من التقدم في دراسات الجذعية البنكرياس والسلف بيولوجيا الخلية. جوهر مقايسة مستعمرة هو أنه يقيس القدرة الذاتية للخلايا الاصلية ، بدلا من النمط الظاهري فقط ، مما يسمح لوحظ أن وظائف وإمكانات نسب من الخلايا الاصلية. بل هو أيضا أداة الكمية التي يمكن تحديد عدد الأسلاف في عدد معين من السكان. في مجال الخلايا الجذعية المكونة للدم ، لعبت أدوارا مهمة المقايسات مستعمرة في تحديد الهوية ، فضلا عن فك رموز متطلبات عامل النمو ، والتفاعلات ، والآليات التي تحكم التزام نسب هذه الخلايا. 6 وفي مجال السلف البنكرياس بيولوجيا الخلية وجهاز البنكرياس 7 (8) ، أو الجزء الأكبر الثقافات 9-13 وقد وضعت ولكن هذه المقايسات لا تعالج questi البيولوجيةإضافات على مستوى خلية واحدة. دون تحليلات خلية واحدة ، لا يمكن وجود البنكرياس الجذعية المتعددة المحتملة / أسلاف يثبت بشكل لا لبس فيه (14).
هنا نظهر أن الانسولين معربا عن تشكيل مستعمرة الأسلاف يمكن يعاير باستخدام ثلاثي الأبعاد ، والتي تحتوي على Matrigel ، ثقافة النظام شبه صلبة. على الرغم من أنه تم تطوير نظام تعليق 15،16 الثقافة الذي يسمح احد الأسلاف البنكرياس البالغين لتتكاثر وتتمايز إلى "pancreatospheres" ، مقايسة لدينا مستعمرة يوفر مزايا إضافية. أولا ، لدينا شبه صلبة وسائل الاعلام نظام يسمح الثقافة الطلاء لمدة تصل إلى 25،000 الخلايا فرز لكل 500 ميكرولتر الثقافة وسائل الإعلام لكل بئر – 24 مع الحفاظ على تشكيل مستعمرة مما أدى إلى مجموعة خطية. 2 وفي المقابل ، فإن مقايسة pancreatosphere تعليق يتطلب استخدام واحد طريقة ترسب الخلايا من الخلية فارز للسماح بتحليل خلية واحدة ، وبالتالي حجم أكبر من وسائل الإعلام والثقافة ، وحاضنة الفضاءمطلوبة. لذلك ، لدينا تجربة مستعمرة من السهل نسبيا وفعالة من حيث التكلفة لإجراء عندما بدأت أعداد كبيرة من خلايا مختلفة تحتاج إلى وقت واحد مقابل لأنشطة السلف. الثانية ، لدينا شبه صلبة وسائل الإعلام يسمح التوزيع الموحد لمكونات المصفوفة خارج الخلية ، وعوامل النمو ، والذي يسمح كل من انتشار الأسلحة النووية وتمايز تحدث في نفس البئر. في المقابل ، فإنه من الصعب توفير هذه البيئة ، ولا سيما مصفوفة ، إلى الخلايا في الثقافة الايقاف. نحن ندرك أنه مع اسلوبنا لا يمكن أن تثبت بشكل قاطع أن يتم اشتقاق كل مستعمرة من خلية واحدة ، كما يمكن ان اثنين من أسلاف المتمركزة بالقرب من كل مستعمرة عشوائيا الآخر والشكل. ومع ذلك ، يمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق تحليل ثانوي التلاعب به واحد الخلية. ويمكن مباشرة انتقاء واحد من الخلايا فرز تثبت بشكل قاطع الأصل خلية واحدة في كل مستعمرة.
باختصار ، للانسولين والتعبير عن تشكيل مستعمرة نشاط المواليةوصف genitors في شبه صلبة وسائل الاعلام هنا يوفر فرصا فريدة للدراسات الميكانيكية للأسلاف البنكرياس على مستوى خلية واحدة. على سبيل المثال ، في تقرير سابق وجدنا أن إضافة Matrigel ، وهي مزيج النفط الخام من البروتينات المصفوفة خارج الخلية ، في الثقافة هو مطلوب وسائل الاعلام عن تشكيل الانسولين معربا عن مستعمرات من خلايا + Ngn3 – EGFP (2) ، مما يدل على المصفوفة خارج الخلية هو المهم بالنسبة لأولئك الأسلاف. باستخدام هذا الاختبار مستعمرة ، سيكون من الممكن الآن لمزيد من تشريح وتحديد الاحتياجات مصفوفة محددة لمثل هذا النشاط. بالإضافة إلى دراسة الأسلاف المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية ، ونحن حاليا بالتحقيق في ما إذا كان هذا الفحص المختبري في النظام كما يدعم تشكيل المستعمرات المميزة الأخرى المستمدة من البنكرياس والكبد من الفئران قبل الولادة والكبار ، وكذلك من الأنسجة البشرية البنكرياس جثي خالية من الجزر.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور كلاوس Kaestner لهبة Ngn3 – الفئران الجذعية الجنينية EGFP خط الخلية ، والسيدة لوسي براون وجوهر الخلوي التحليلية للمساعدة في فرز الخلايا. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من المنح والمعاهد الوطنية للصحة R21DK069997 R01DK081587 ومنحت لHTK من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) المنح التدريبية التي تمنح للميغاواط وLS
Material/ Reagent | Company | Catalogue Number |
Comments |
1X DMEM/ F-12 (1:1) | Mediatech | 15-090-CV | |
Fetal Calf Serum | Tissue Culture Biologicals |
201 | Refer to Section 1.1 |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
1X Dulbecco’s PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
Bovine Serum Albumin |
Sigma | A8412 | 7.5 % |
Matrigel | Becton Dickinson |
356231 | Reduced Growth Factor |
Methylcellulose | Sinetsu Chemical, Tokyo, Japan |
1,500 centipoise (high-viscosity) |
|
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
Human Recombinant Activin βB |
R & D Systems | 659-AB-025 | |
Exendin-4 | Sigma | E7144 | |
Human Recombinant VEGF-A |
R & D Systems | 293-VE-010 | |
24-well plates | Costar | 3473 | Ultra-low Attachment |
60mm Petri Dish with Grid |
Nunc | 169558 |