Essai de calcium à base de cellules pour les moyennes et criblage à haut débit fonctions de canaux TRP utilisant Flexstation 3

Résumé

Cette vidéo fournit un protocole détaillé pour l'étude du profil pharmacologique de canaux à l'aide humaine TRPA1 Flexstation 3. Le protocole couvre les détails de préparation de cellules, le colorant de charge et le fonctionnement du lecteur de microplaques, Flexstation 3.

Résumé

Flexstation La Molecular Devices '3 est une paillasse multi-mode lecteur de microplaques capable de mesure de la fluorescence automatisé plaques multi-puits. Elle est idéale pour les moyennes et à haut débit écrans dans les milieux universitaires. Il dispose d'un module de transfert de fluide intégré équipé d'un pipetteur multi-canal et la machine lit une colonne à la fois de surveiller les changements de fluorescence d'une variété de réactifs fluorescents. Par exemple, Flexstation 3 a été utilisé pour étudier la fonction de Ca ^{2 +-perméable} canaux ioniques et G récepteurs couplés aux protéines en mesurant les changements de libre intracellulaire de Ca ^{2 +} niveaux. Transitoire des récepteurs potentiels (TRP) des canaux sont une grande famille de canaux cationiques non sélectifs qui jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions physiologiques et physiopathologiques. La plupart des canaux TRP sont perméables de calcium et d'induire l'influx de calcium lors de l'activation. Dans cette vidéo, nous démontrons l'application de Flexstation 3 pour étudier le profil pharmacologique de la voie TRPA1, un capteur moléculaire pour de nombreux stimuli nocifs. Cellules HEK293 exprimant de façon stable ou transitoire humaine TRPA1 canaux, cultivés dans des plaques 96 puits, sont chargés avec un Ca ^{2 +} sensibles au colorant fluorescent, Fluo-4, et en temps réel les changements de fluorescence de ces cellules sont mesurés avant et pendant l'application de la un agoniste TRPA1 utilisant le mode FLEX de l'Flexstation 3. L'effet d'une putative TRPA1 antagoniste a été également examiné. Les données sont transférées à partir du logiciel Pro SoftMax de construire des relations concentration-réponse du TRPA1 activateurs et inhibiteurs.

Protocole

1. Les préparations de cellules dans des plaques 96 puits

Pour les cellules HEK293 transitoirement trasfected avec TRPA1 ADNc humain

1. HEK293 cellules sont cultivées pendant un à deux jours dans Dulbecco Minimal Essential Medium (DMEM) contenant 4,5 mg / ml de glucose (Thermo Scientific, SH3002201), complétée par inactivé à la chaleur 10% de sérum de veau fœtal (Invitrogen, 16000-044), 50 unités / ml de pénicilline et 50 pg / ml de streptomycine (Invitrogen, 15140-163). Le jour de la transfection, la densité cellulaire devrait atteindre 70-90%.
2. Manteau plaques à 96 puits par pipetage 50 ul de poly-L-ornithine (....

Discussion

Intracellulaire de Ca ^{2 +} joue un rôle important dans de nombreuses conditions physiologiques et pathologiques, tels que libération des neurotransmetteurs (3), le potentiel d'action cardiaque (4), la contraction des cellules musculaires (5), la transduction du signal cellulaire (6-7), et la mort cellulaire excitotoxique ( 8). Mesure de Ca ^{2 +} intracellulaire niveaux aide à élucider les changements fonctionnels de Ca ^{2 +-canaux} perméables dans la membrane plasmique ou organites intrac.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Flexstation 3	Molecular Devices	Flex3
96-Eh bien, embouts de pipettes Flexstation	Molecular Devices	9000-0912
Plaques de 96 puits	Greiner Bio-One	655090
96-Eh bien clair plaques à fond plat	Costar	3595
DMEM	Invitrogen	12430-104
Opti-MEM	Invitrogen	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Fluo-quatre heures	Invitrogen	F14202
PluronicF-127	Invitrogen	P3000MP
Poly-L-ornithine	Sigma	P36551
probénécide	Sigma	P8761
L'albumine sérique bovine	Sigma	A9418