Essai de calcium à base de cellules pour les moyennes et criblage à haut débit fonctions de canaux TRP utilisant Flexstation 3
Summary
Cette vidéo fournit un protocole détaillé pour l'étude du profil pharmacologique de canaux à l'aide humaine TRPA1 Flexstation 3. Le protocole couvre les détails de préparation de cellules, le colorant de charge et le fonctionnement du lecteur de microplaques, Flexstation 3.
Abstract
Flexstation La Molecular Devices '3 est une paillasse multi-mode lecteur de microplaques capable de mesure de la fluorescence automatisé plaques multi-puits. Elle est idéale pour les moyennes et à haut débit écrans dans les milieux universitaires. Il dispose d'un module de transfert de fluide intégré équipé d'un pipetteur multi-canal et la machine lit une colonne à la fois de surveiller les changements de fluorescence d'une variété de réactifs fluorescents. Par exemple, Flexstation 3 a été utilisé pour étudier la fonction de Ca 2 +-perméable canaux ioniques et G récepteurs couplés aux protéines en mesurant les changements de libre intracellulaire de Ca 2 + niveaux. Transitoire des récepteurs potentiels (TRP) des canaux sont une grande famille de canaux cationiques non sélectifs qui jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions physiologiques et physiopathologiques. La plupart des canaux TRP sont perméables de calcium et d'induire l'influx de calcium lors de l'activation. Dans cette vidéo, nous démontrons l'application de Flexstation 3 pour étudier le profil pharmacologique de la voie TRPA1, un capteur moléculaire pour de nombreux stimuli nocifs. Cellules HEK293 exprimant de façon stable ou transitoire humaine TRPA1 canaux, cultivés dans des plaques 96 puits, sont chargés avec un Ca 2 + sensibles au colorant fluorescent, Fluo-4, et en temps réel les changements de fluorescence de ces cellules sont mesurés avant et pendant l'application de la un agoniste TRPA1 utilisant le mode FLEX de l'Flexstation 3. L'effet d'une putative TRPA1 antagoniste a été également examiné. Les données sont transférées à partir du logiciel Pro SoftMax de construire des relations concentration-réponse du TRPA1 activateurs et inhibiteurs.
Protocol
Discussion
Intracellulaire de Ca 2 + joue un rôle important dans de nombreuses conditions physiologiques et pathologiques, tels que libération des neurotransmetteurs (3), le potentiel d'action cardiaque (4), la contraction des cellules musculaires (5), la transduction du signal cellulaire (6-7), et la mort cellulaire excitotoxique ( 8). Mesure de Ca 2 + intracellulaire niveaux aide à élucider les changements fonctionnels de Ca 2 +-canaux perméables dans la membrane plasmique ou organites i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les Drs. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris et Olga Chumakova pour leur soutien. Le système est Flexstation 3 cadre de la Facilité d'imagerie Cytodynamic UTHSC. Nous remercions également les docteurs. Ardem Patapoutian et Michael Bandell du Scripps Research Institute et l'Institut de génomique de la Fondation Novartis pour la recherche (GNF) pour fournir la lignée cellulaire HEK293-hTRPA1 stable. La recherche est financée en partie par des subventions du NIH (GM081658 à MXZ) et le Texas Medical Center Digestive Diseases Center (à HH) et la Mission Connect / TIRR Fondation (à HH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-one | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P36551 | |
| probenecid | Sigma | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 |
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