मध्यम के लिए सेल आधारित कैल्शियम टीआरपी चैनल कार्य की उच्च Throughput स्क्रीनिंग 3 FlexStation का उपयोग करने के लिए परख
Summary
यह वीडियो मानव TRPA1 FlexStation का उपयोग 3 चैनलों के औषधीय प्रोफ़ाइल का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है. प्रोटोकॉल सेल तैयारी, डाई लोड हो रहा है और microplate रीडर, 3 FlexStation के आपरेशन के विवरण शामिल हैं.
Abstract
आण्विक 'औज़ार 3 FlexStation एक benchtop बहु मोड microplate बहु अच्छी तरह प्लेटें में स्वचालित प्रतिदीप्ति माप के सक्षम पाठक है. यह शैक्षिक सेटिंग्स में मध्यम से उच्च throughput स्क्रीन के लिए आदर्श है. यह एक एकीकृत तरल हस्तांतरण के साथ एक मल्टी चैनल pipetter और मशीन फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों की एक किस्म के प्रतिदीप्ति परिवर्तन की निगरानी के लिए एक समय में एक स्तंभ पढ़ता सुसज्जित मॉड्यूल है. उदाहरण के लिए, 3 FlexStation intracellular मुक्त Ca + 2 स्तर के परिवर्तन को मापने के द्वारा + पारगम्य आयन चैनलों और जी प्रोटीन रिसेप्टर्स मिलकर समारोह के 2 Ca अध्ययन किया गया है. क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनल (टीआरपी) nonselective कटियन चैनलों कि कई शारीरिक और pathophysiological कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के एक बड़े परिवार कर रहे हैं. टीआरपी चैनलों के अधिकांश कैल्शियम पारगम्य हैं और सक्रियण पर कैल्शियम बाढ़ प्रेरित. इस वीडियो में, हम 3 FlexStation TRPA1 चैनल, कई हानिकारक उत्तेजनाओं के लिए एक आणविक संवेदक के औषधीय प्रोफ़ाइल का अध्ययन करने के आवेदन को प्रदर्शित करता है. HEK293 transiently या stably मानव TRPA1 चैनल, 96 अच्छी तरह प्लेटों में हो, व्यक्त कोशिकाओं + संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक 2 ca, Fluo-4, और इन कोशिकाओं में वास्तविक समय प्रतिदीप्ति परिवर्तन के साथ लोड कर रहे हैं पहले और के आवेदन के दौरान मापा जाता है एक TRPA1 agonist 3 FlexStation के फ्लेक्स मोड का उपयोग कर. एक ख्यात TRPA1 प्रतिपक्षी के प्रभाव भी जांच की गई थी. डेटा SoftMax प्रो सॉफ्टवेयर से स्थानांतरित कर रहे हैं TRPA1 activators और inhibitors के एकाग्रता प्रतिक्रिया रिश्तों का निर्माण.
Protocol
Discussion
Intracellular Ca 2 + neurotransmitter रिहाई (3), हृदय की संभावित कार्रवाई (4), मांसपेशी कोशिका संकुचन (5), सेल संकेत transduction (6-7), और excitotoxic सेल (मृत्यु के रूप में कई शारीरिक और रोग की स्थिति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है 8). Intracellular Ca 2 +…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डीआरएस धन्यवाद. जॉन Hancock, रे ग्रिल, एंड्रयू मॉरिस और उनके समर्थन के लिए ओल्गा Chumakova. FlexStation 3 प्रणाली UTHSC Cytodynamic इमेजिंग सुविधा का हिस्सा है. हम भी डीआरएस धन्यवाद. Ardem Patapoutian और स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट और HEK293 – hTRPA1 स्थिर सेल लाइन उपलब्ध कराने के लिए नोवार्टिस रिसर्च फाउंडेशन (GNF) के जीनोमिक्स संस्थान से माइकल Bandell. अनुसंधान में भाग (GM081658 MXZ) NIH और टेक्सास मेडिकल सेंटर पाचन रोग केंद्र (HH के लिए) और मिशन कनेक्ट / TIRR फाउंडेशन (HH के लिए) से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-one | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P36551 | |
| probenecid | Sigma | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 |
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