Questo video fornisce un protocollo dettagliato per lo studio del profilo farmacologico di umano TRPA1 canali utilizzando FlexStation 3. Il protocollo comprende dettagli di preparazione delle cellule, il caricamento colorante e il funzionamento del lettore per micropiastre, FlexStation 3.
FlexStation il Molecular Devices '3 è un banco di lavoro multi-mode capaci di lettore per micropiastre automatico di misurazione della fluorescenza multi-pozzetti. E 'ideale per medie e high-throughput schermi in ambienti accademici. Ha un modulo integrato di trasferimento del liquido dotato di un multi-canale pipetter e la macchina legge una colonna alla volta per monitorare le variazioni di fluorescenza di una varietà di reagenti fluorescenti. Per esempio, FlexStation 3 è stato usato per studiare la funzione di Ca 2 +-permeabile canali ionici e G-proteine recettori accoppiati misurando le variazioni di libero intracellulare di Ca 2 + livelli. Transitori recettore potenziale (TRP) i canali sono una grande famiglia di canali di comunicazione non selettivi che svolgono un ruolo importante in molte funzioni fisiologiche e fisiopatologiche. La maggior parte dei canali TRP sono il calcio permeabili e indurre influsso di calcio al momento dell'attivazione. In questo video, dimostriamo l'applicazione di FlexStation 3 a studiare il profilo farmacologico del canale TRPA1, un sensore molecolare per numerosi stimoli nocivi. Cellule HEK293 transitoriamente o stabilmente esprimere umano TRPA1 canali, coltivate in piastre a 96 pozzetti, vengono caricati con Ca 2 +-sensitive colorante fluorescente, Fluo-4, e le modifiche fluorescenza in tempo reale in queste cellule sono misurati prima e durante l'applicazione di un agonista TRPA1 utilizzando la modalità FLEX del FlexStation 3. L'effetto di un putativo TRPA1 antagonista stato anche esaminato. I dati vengono trasferiti dal software SoftMax Pro per la costruzione di concentrazione-risposta di TRPA1 attivatori e inibitori.
Intracellulare di Ca 2 + gioca un ruolo importante in molte condizioni fisiologiche e patologiche, quali rilascio dei neurotrasmettitori (3), potenziale d'azione cardiaco (4), la contrazione delle cellule muscolari (5), trasduzione del segnale cellulare (6-7), e la morte cellulare eccitotossico ( 8). Misura di Ca 2 + intracellulare livelli aiuta a chiarire cambiamenti funzionali di Ca 2 +-permeabile canali nella membrana plasmatica o organelli intracellulari e il contributo di
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The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Drs. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris e Olga Chumakova per il loro supporto. Il sistema a 3 FlexStation fa parte dello strumento UTHSC Imaging Cytodynamic. Ringraziamo anche Drs. Ardem Patapoutian e Michael Bandell dalla Scripps Research Institute e del Genomics Institute della Novartis Research Foundation (GNF) per fornire la linea cellulare HEK293-hTRPA1 stabile. La ricerca è finanziata in parte dalle concessioni dal NIH (GM081658 a MXZ) e Texas Medical Center Digestive Diseases Center (a SS) e Mission Connect / TIRR Foundation (a SS).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
96-Well Plates | Greiner Bio-one | 655090 | |
96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
Poly-L-ornithine | Sigma | P36551 | |
probenecid | Sigma | P8761 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 |