Cell-baserad Kalcium-analys för medelstora till stora throughput screening av TRP-kanaler funktioner med FlexStation 3
Summary
Den här videon ger en detaljerad protokoll för att studera den farmakologiska profilen för mänskliga TRPA1 kanaler med FlexStation 3. Protokollet omfattar detaljer cellberedningen, preparat lastning och drift av mikroplattan läsare, FlexStation 3.
Abstract
Molecular Devices "FlexStation 3 är en bänk multi-mode mikrotiterplatta läsare kan automatiserade fluorescens mätning i flera bra plattor. Den är idealisk för medel-till hög kapacitet skärmar i akademisk miljö. Den har en integrerad modul vätska överföra utrustad med ett flerkanals pipetter och maskinen läser en kolumn i taget för att övervaka fluorescens förändringar av olika fluorescerande reagenser. Till exempel har FlexStation 3 använts för att studera funktionen av Ca2 +-genomsläpplig jonkanaler och G-proteinkopplade receptorer genom att mäta förändringar av intracellulära fria Ca 2 + nivåer. Transient receptor potential (TRP) kanaler är en stor familj av icke-selektiva ning kanaler som spelar en viktig roll i många fysiologiska och patofysiologiska funktioner. De flesta av TRP-kanaler är kalcium genomsläpplig och framkalla kalciuminflödet vid aktivering. I denna video visar vi tillämpningen av FlexStation 3 för att studera den farmakologiska profil TRPA1 kanal, en molekylär sensor för många skadliga stimuli. HEK293 celler tillfälligt eller stabilt uttrycka mänskliga TRPA1 kanaler, som odlas i 96-brunnars plattor, är laddade med en Ca2 +-känsliga fluorescerande färg, Fluo-4 och realtid fluorescens förändringar i dessa celler mäts före och under tillämpningen av en TRPA1 agonist med FLEX läget i FlexStation 3. Effekten av en förmodad TRPA1 antagonist undersöktes också. Data överförs från SoftMax Pro att bygga koncentration-respons-relationer TRPA1 aktivatorer och hämmare.
Protocol
Discussion
Intracellulär Ca 2 + spelar en viktig roll i många fysiologiska och patologiska tillstånd, såsom frisättningen av neurotransmittorer (3), hjärt aktionspotential (4), muskelcell kontraktion (5), cell signaltransduktion (6-7), och excitotoxic celldöd ( 8). Mätning av intracellulära Ca 2 + nivåer bidrar till att belysa funktionella förändringar av Ca2 +-genomsläppliga kanaler i plasmamembranet eller intracellulära organeller och bidrag
Ca 2 + till …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris och Olga Chumakova för deras stöd. Det FlexStation 3-systemet är en del av UTHSC Cytodynamic Imaging Facility. Vi vill också tacka Dr. Ardem Patapoutian och Michael Bandell från Scripps Research Institute och genomik Institutet för Novartis Research Foundation (GNF) för att tillhandahålla HEK293-hTRPA1 stabil cellinje. Forskningen stöds delvis av anslag från NIH (GM081658 till MXZ) och Texas Medical Center matsmältningssjukdomar Center (till HH) och Mission Anslut / TIRR Foundation (till HH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-one | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P36551 | |
| probenecid | Sigma | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 |
References
- Hu, H. Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).
- Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels. Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).
- Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons. Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).
- Mason, S. A., MacLeod, K. T. Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females. Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).
- Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline. Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).
- Alagarsamy, S., Johnson, K. M. Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS. Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).
- Su, L. T. TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain. J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).
- Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. Intracellular calcium concentrations during “chemical hypoxia” and excitotoxic neuronal injury. J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).
- George, J. Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons. J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).
- Price, K. L., Lummis, S. C. FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ – and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems. J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).
- Laude, A. J. Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors. Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).
- Marincsak, R. The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1. Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).
- Xie, X. Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol. 5, 191-203 (2007).
- Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).
- Boulay, G. Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein. J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).
- Nanda, K. Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter. Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).
