FlexStation kullanarak 3 TRP Kanal İşlevleri Yüksek Verimli Tarama Orta Hücre tabanlı Kalsiyum Testi
Summary
Bu video FlexStation 3 kullanarak insan TRPA1 kanalları farmakolojik profili çalışmak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Protokol hücre hazırlama, boya yükleme ve mikroplaka okuyucu, FlexStation 3 operasyon detayları kapsar.
Abstract
Moleküler Aygıtlar FlexStation 3, çok iyi plakaları otomatik floresan ölçüm yeteneğine bir masa üstü multi-mode mikroplaka okuyucu. Akademik ayarları orta-yüksek verimli ekranlar için idealdir. Bu bir multi-kanal pipetter ve makinenin bir defada bir çok floresan reaktiflerin floresan değişiklikleri izlemek için bir sütun okur ile donatılmış entegre bir sıvı aktarım modülü vardır. Örneğin, FlexStation 3 Ca 2 + geçirgen iyon kanalları ve G-protein reseptörler hücre içi serbest Ca 2 + düzeyleri değişiklikleri ölçerek işlevini incelemek için kullanılmıştır. Geçici reseptör potansiyeli (TRP) kanalları, pek çok fizyolojik ve patofizyolojik fonksiyonlarında önemli rol oynamaktadır seçici olmayan katyon kanalları büyük bir aileyiz. TRP kanalları çoğu kalsiyum geçirgen ve etkinleştirme sırasında kalsiyum akını neden. Bu video, TRPA1 kanal, çok sayıda Ağrılı uyaranlara için bir moleküler sensör farmakolojik profil çalışma FlexStation 3 uygulama göstermektedir. Geçici ya da stabil bir şekilde 96-kuyucuğu yetişen insan TRPA1 kanal, ifade HEK293 hücreleri floresan boya + duyarlı Ca 2, Fluo-4, ve bu hücrelerin gerçek zamanlı floresan değişiklikler ile yüklenen uygulama öncesi ve sırasında ölçülen FlexStation 3 FLEX modunu kullanarak bir TRPA1 agonist. Varsayılan TRPA1 antagonisti etkisi de incelenmiştir. Veri SoftMax Pro yazılımı TRPA1 aktivatörleri ve inhibitörleri konsantrasyon-yanıt ilişkileri oluşturmak için transfer edilir.
Protocol
Discussion
Hücre içi Ca 2 +, nörotransmitter sürüm (3), kardiyak aksiyon potansiyeli (4), kas hücresi kasılma (5), hücre sinyal iletimi (6-7) ve eksitotoksik hücre ölümü (gibi pek çok fizyolojik ve patolojik koşullar, önemli bir rol oynar 8). Hücre içi Ca 2 + seviyeleri ölçümü fonksiyonel değişiklikler ve Ca 2 + geçirgen kanallar plazma zarı ya da hücre içi organelleri katkısı aydınlatmak için yardımcı olur
Ca 2 + yukarıdaki süreçleri (9-13). Ta…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr teşekkür ederim. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris ve verdikleri destek için Olga Chumakova. FlexStation 3 sisteminin UTHSC Cytodynamic Görüntüleme Tesis bir parçası. Ayrıca Dr teşekkür. Scripps Araştırma Enstitüsü ve HEK293-hTRPA1 istikrarlı hücre hattı sağlamak için Novartis Araştırma Vakfı (GNF) Genomik Enstitüsü Ardem Patapoutian ve Michael Bandell. Araştırma NIH (MXZ için GM081658) ve Texas Tıp Merkezi Sindirim Hastalıkları Merkezi (HH) ve Mission Bağlan / TIRR Vakfı (HH) hibe kısmen desteklenmektedir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-one | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P36551 | |
| probenecid | Sigma | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 |
References
- Hu, H. Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).
- Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels. Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).
- Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons. Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).
- Mason, S. A., MacLeod, K. T. Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females. Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).
- Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline. Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).
- Alagarsamy, S., Johnson, K. M. Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS. Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).
- Su, L. T. TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain. J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).
- Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. Intracellular calcium concentrations during “chemical hypoxia” and excitotoxic neuronal injury. J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).
- George, J. Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons. J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).
- Price, K. L., Lummis, S. C. FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ – and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems. J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).
- Laude, A. J. Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors. Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).
- Marincsak, R. The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1. Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).
- Xie, X. Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol. 5, 191-203 (2007).
- Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).
- Boulay, G. Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein. J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).
- Nanda, K. Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter. Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).
