Beredning av viral DNA från Nucleocapsids
Summary
Vi beskriver processen att isolera hög renhet herpesvirus nukleokapsid DNA från infekterade celler. Den slutliga DNA fångas från lösning med hög koncentration och renhet, vilket gör den idealisk för hög genomströmning sekvensering, high fidelity PCR reaktioner och transfections att producera nya virus rekombinanter.
Abstract
Virus är obligata cellulära parasiter, och därmed att studera deras DNA kräver att isolera virus material från värdcellen föroreningar och DNA. Flera nedströms tillämpningar kräver stora mängder ren virus-DNA, som tillhandahålls genom detta protokoll. Dessa applikationer inkluderar virusgenom sekvensering, där avlägsnande av värd-DNA är avgörande för att optimera utdata för viral sekvenser, och produktionen av nya virus rekombinanta stammar, där samarbetet transfektion av renat plasmiden och linjär viralt DNA underlättar rekombination. 1,2, 3
Detta förfarande använder en kombination av extraktioner och täthet-baserade centrifugering för att isolera renas linjär herpesvirus nukleokapsid DNA från infekterade celler. 4,5 Den inledande reningssteg syftar till att isolera renat virus capsids, som innehåller och skyddar den virala DNA under extraktioner och steg centrifugering som tar bort cellulära proteiner och DNA. Lys av nucleocapsids släpper sedan viralt DNA, och två sista fenol-kloroform steg bort återstående proteiner. Den slutliga DNA fångas från Lösningen är mycket koncentrerad och ren, med en genomsnittlig OD 260/280 på 1,90. Beroende på mängden infekterade används celler, ger av virus-DNA intervallet 150 till 800 mikrogram eller mer. Renheten av detta DNA gör den stabil under långvarig förvaring vid 4C. Detta DNA är därför idealisk för hög genomströmning sekvensering, high fidelity PCR reaktioner och transfections.
Före början protokollet är det viktigt att veta det genomsnittliga antalet celler per fat (t.ex. i genomsnitt 8 x 10 6 PK-15 celler i ett sammanhängande 15 cm fat), och titer av virala materiel som skall användas ( t.ex. 1 x 10 8 plaque-forming enheter per ml). Dessa är nödvändiga för att räkna ut rätt mängd av infektion (MOI) för protokollet. 6 Till exempel för att infektera en 15 cm parabolantenn i PK-15 celler med ovanstående virus beståndet, i ett MOI av 5, vill du använda 400 ìl virala lager och späd den med 3,6 ml medium (totalt ympning volym på 4 ml för en 15 cm platta).
Flera viralt DNA preparat kan vara beredd på samma gång. Antalet samtidiga förberedelserna begränsas bara av antalet rör som innehas av ultracentrifugen rotorn (en per-virus, se steg 3,9 nedan). Här beskriver vi proceduren som om görs för ett virus.
Protocol
Discussion
Delar av detta protokoll utvecklades ursprungligen för viralt DNA isolering i BSL4 förhållanden, men den anpassar lika bra för icke-BSL villkor. 4 Vi brukar använda det här protokollet för att isolera DNA från alfa-herpesvirus PRV och HSV-1, som har DNA-genomet inneslutna i ett proteinhaltig kapsid och omgiven av en lipid kuvert. 7,8 Det är dock sannolikt direkt kan anpassas till andra stora DNA-virus, inklusive beta-och gamma-herpesvirus och adenovirus. Liknande extraktioner används ofta…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna uppskattar bidragen från Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman, Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, och medlemmar av Enquist lab i finjusterande detta protokoll.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane) | Fisher | T178-4 | Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9 |
| Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity | 5 PRIME | 2302850 | Optional |
| Polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman* | 331372* | *Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma | I-3021 | |
| PK-15 cells | ATCC | CCL-33 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | HyClone | SH30028.03 |
References
- Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations. J Virol. 84, 5303-5313 (2010).
- Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications. J Virol. 77, 10106-10112 (2003).
- Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes. Nat Commun. 1, 146-146 (2010).
- Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector. Science. 203, 541-544 (1979).
- Smith, G. A., Enquist, L. W. Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J Virol. 73, 6405-6414 (1999).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of virology. , (2008).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).
- Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virology. , 2381-2397 (2001).
- Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus. J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).
- Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus. J Med Virol. 31, 129-134 (1990).
- Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus. PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).
