Alexa Fluor Etiketleme Dang Virüs görselleştirme
Summary
Fluorofor geliştirme ve görüntüleme teknolojisi, virüs, virüs ve hücre arasındaki ilk etkileşimleri görselleştirmek için geliştirildi dang Alexa Fluor etiketleme basit bir yöntem gelişmeler yararlanan.
Abstract
Virüs ve hücre arasındaki etkileşimin erken olaylar enfeksiyon sonucu üzerinde derin bir etkiye sahip olabilir. Bu etkileşimin etkileyen faktörlerin belirlenmesi, hastalık patogenezi daha iyi anlaşılması için yol ve böylece aşı veya tedavi edici tasarımı etkileyebilir. Bu nedenle, bu etkileşimin prob yöntemlerin geliştirilmesi yararlı olacaktır. Fluorophores geliştirme 1-3 ve görüntüleme teknolojisi 4, son gelişmeler, dang patogenezi ile ilgili mevcut bilgi geliştirmek ve böylece milyonlarca yılda meydana gelen dang enfeksiyonları azaltmak için önünü yararlanılabilir.
Zarflı Dang virüsü tek bir pozitif iplikli RNA genomu 5 içeren nucleocapsid kabuk korunması, 90 zarf glikoprotein (E) dimerleri oluşan harici bir iskele vardır. Böylece virüsün yüzeyinde aynı protein altbirimden amin reaktif boya ile etiketlenmiş ve immunofluorescent mikroskobu yoluyla görüntülendi olabilir. Burada, Alexa Fluor succinimidyl ester boya etiketleme sonra, son derece canlı virüs vermiştir sodyum bikarbonat tampon doğrudan çözünmüş dang virüsü etiketleme basit bir yöntem mevcut. Canlı virüs ve protein etiketleme genellikle dimetil sülfoksit boya sulandırılması gereklidir mevcut üretici protokol etiketlenmesi için standart bir prosedür yoktur. Varlığı, dimetil sülfoksit dakika miktarlarda bile, virüs verimli enfeksiyonu engellemek ve aynı zamanda hücre sitotoksik 6 neden. Bu protokol dimetil sülfoksit kullanımı dışlama böylece bu olasılığı azalır. Alexa Fluor boyalar üstün fotostabilite ve hücresel alımı ve virüs endosomal taşıma çalışmaları için ideal hale getirir, floresein ve rodamin 2 olarak ortak boyalar, daha az pH duyarlı . Alexa Fluor boya konjugasyon virüs spesifik antikor ve konak hücrelerine 7 varsayılan reseptörleri etiketli Dang virüsü tanıma etkilemedi. Bu yöntem, virolojik çalışmalarda faydalı uygulamalar olabilir.
Protocol
Discussion
Bu raporda AF594 boya kullanılmış olmasına rağmen, Alexa Fluor succinimidyl esterleri serisi fluorophores geniş bir yelpazede benzer etiketleme kimyası ile kullanılabilir. Bu etiketleme uygulaması görüntüleme ötesinde genişletmek olabilir. Flow sitometri, heyecanlı ve FACS makine ile tespit edilebilir fluorophores etiketleme derecesini tahmin etmek için konfokal mikroskopi bir alternatif olarak kullanılabilir.
Alexa Fluor boyalar, serbest amino grupları, öncelikle arginin …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Singapur Ulusal Tıp Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Invitrogen | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nunc | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10X1L | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 |
To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
References
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. The Fluorescent Protein Color Palette. Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- . . Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).
- Huang, S. Analysis of proteins stained by Alexa dyes. Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).
- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
