En nem og bekvem metode til at bestemme omfanget af gap junction sporstof kobling mellem retinale neuroner er beskrevet. Denne teknik gør det muligt for en til at undersøge funktionen af de elektriske synapser mellem neuroner i den intakte nethinden under forskellige lys forhold og på forskellige tidspunkter af dagen og natten.
Ud over kemisk synaptisk transmission, kan neuroner, der er forbundet med gap junctions også kommunikere hurtigt via elektriske synaptisk transmission. Stigende tyder på, at gap junctions ikke kun tillader elektrisk strøm og synkrone aktivitet mellem forbundne eller koblede celler, men at styrke eller effektivitet af elektrisk kommunikation mellem koblet celler kan afpasses i høj grad 1,2. Herudover giver det store indre diameter (~ 1,2 nm) af mange gap junction-kanaler ikke kun elektrisk strøm, men også udbredelsen af intracellulære signalstoffer og mindre metabolitter af indbyrdes forbundet celler, således at gap junctions kan også mægle metabolisk og kemisk kommunikation . Styrken af kløften Junctional kommunikation mellem neuroner og dets graduering af neurotransmittere og andre faktorer kan studeres ved samtidig elektrisk optagelse fra koblede celler og ved at bestemme than omfanget af spredning af tracer molekyler, som er gap junction gennemtrængelige, men ikke membran gennemtrængelige, efter Iontoforetisk injektion i enkelte celler. Dog kan disse procedurer være yderst vanskeligt at udføre på neuroner med små somata i intakte neurale væv.
Talrige undersøgelser af elektriske synapser og modulering af elektriske kommunikation er blevet gennemført i hvirveldyr nethinden, da hver af de fem retinale neuron typer elektrisk tilsluttes via gap junctions 3,4. Stigende beviser har vist, at døgnrytmen (24-timers) uret i nethinden og ændringer i lyset stimulation regulere gap junctions kobling 3-8. For eksempel har seneste arbejde vist, at retinale døgnrytmen ur falder gap junctions kobling mellem stang og kegle fotoreceptorceller i løbet af dagen ved at øge dopamin D2-receptor-aktivering, og dramatisk øger stang-kegle kobling natten ved at reducere D2 receptor aktivering <sup> 7,8. Men ikke alene er disse undersøgelser yderst vanskeligt at udføre på neuroner med små somata i intakte neurale nethinde væv, men det kan være svært at tilstrækkelig kontrol belysningen forhold under elektrofysiologiske undersøgelse med enkeltdosis retinale neuroner for at undgå lys-inducerede ændringer i gap junctions ledningsevne.
Her præsenterer vi en simpel metode til bestemmelse af omfanget af gap junction sporstof kobling mellem nethinde neuroner under forskellige lys forhold og på forskellige tidspunkter af dagen og natten. Dette cut-loading teknik er en modifikation af skraber læsning 9-12, som er baseret på farve lastning og diffusion gennem åbne gap junctions kanaler. Skrab loading fungerer godt i dyrkede celler, men ikke i tykke skiver som intakt nethinder. Cut-loading teknik har været brugt til at studere fotoreceptorer kobling i intakte fisk og pattedyr nethinder 7, 8,13, og kan bruges til at undersøge koblingen mellemandre retinal neuroner, som beskrevet her.
Cut-loading-metoden beskrevet her er en nyttig og enkel teknik til at bestemme omfanget af gap junction sporstof kobling mellem retinale neuroner under forskellige lys forhold og på forskellige tidspunkter af dagen og natten. Fordele ved denne teknik omfatter muligheden for at kvantificere omfanget af gap junction sporstof kobling mellem neuroner i intakte retinal væv under en række af belysning betingelser i løbet af dagen og natten og til at gøre det til koblet neuroner, der har lille diameter somata. Begrænsninger af teknikken i studiet af gap junctions i intakt væv, falder i to overordnede kategorier. For det første kan sporstof diffusion gennem åbne gap junctions være forholdsvis vanskelige at observere på grund af a) den lille diameter eller afgift i forbindelse med de åbne kanaler og b) den relative mængder af koblede cellulære rum 1,14,15. Det vil sige, sporstof diffusion fra en lille celle til en større celle eller en gruppe af koblede celler, compared til tracer diffusion fra et større celle til en mindre celle, kan være mere vanskeligt at opdage på grund af tracer fortynding. For det andet, under visse fysiologiske forhold, kan omfanget af sporstof diffusion gennem gap junctions i intakt væv ikke præcist afspejler styrken af kløften Junctional ledningsevne på grund af forskelle i konduktans af små elektriske strømførende ioner, sammenlignet med permeabilitet af relativt store tracer molekyler 1,14,15. I almindelighed stærkt bevis på sporstof kobling tyder på tilstedeværelsen af velfungerende, åbne gap junction-kanaler, men under visse fysiologiske forhold, kan sporstof diffusion ikke forekomme eller observeres, selvom elektrofysiologiske optagelser tyder på tilstedeværelsen af velfungerende, åbne gap junctions.
Det virker sandsynligt, at cut-loading teknikken også kan bruges til at undersøge omfanget af gap junction sporstof kobling mellem neuroner i intakt væv fra andre dele af centralnervesystemet system.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af NIH give EY005102 til SCM og EY018640 til CPR
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | 150 mg/L of buffered fish tank water |
Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | 2 g/kgloading dose |
Dual Tube Night Vision Goggle | Night Optics USA | D-221 | |
Filter Paper, Grade No. 4 | Whatman | 1004-090 | |
Fine Forceps, Dumont No. 5, Biologie, 11 cm long | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Fine Scissors, spring-loaded, 8 mm blade, straight | Fine Science Tools | 15025-10 | |
Neurobiotin | Vector | SP-1120 | 0.5% |
Streptavidin-conjugated Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | 2% |
Dextran rhodamine(high (> 10,000) MW) | Invitrogen | D1817 | 0.5% |
Vectashield mounting medium | Vector | H-1000 | |
Zeiss 510 META Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 | Carl Zeiss, Inc. | ||
ImageJ Software | NIH | ||
OriginPro 8.0 | OriginLab Corp. |