La purificación de Hsp104, una proteína Disaggregase
Summary
Aquí se describe un protocolo para la purificación de gran actividad Hsp104, un AAA hexameric + proteína de la levadura, que se acopla la hidrólisis de ATP con el desglose de proteínas. Este esquema se aprovecha de una construcción de His6-etiquetados para la purificación de afinidad de<em> E. coli</em> Seguido por cromatografía de intercambio aniónico, His6-tag con la eliminación de la proteasa TEV, y la cromatografía de exclusión por tamaño.
Abstract
Hsp104 es un hexameric AAA + proteína 1 de la levadura, que se acopla la hidrólisis del ATP a la proteína de desagregación 2-10 (Fig. 1). Esta actividad se imparte dos ventajas selectivas clave. En primer lugar, la renaturalización de los agregados desordenados por Hsp104 faculta la supervivencia de hongos después de varios mal plegamiento de proteínas, destaca, como golpe de calor 3,5,11,12. En segundo lugar, la remodelación de las fibrillas de amiloide-beta cruzada por Hsp104 permite a la levadura para explotar miles de priones (amiloides infecciosas) como un reservorio de beneficios y las variaciones hereditarias fenotípica 13-22. Sorprendentemente, Hsp104 directamente remodelaciones oligómeros preamyloid y fibrillas de amiloide, incluyendo los que forman parte de las proteínas de priones de levadura Sup35 y 23-30 Ure2. Esta funcionalidad-amiloide remodelación es una faceta especializada de la levadura Hsp104. La E. orthologue coli, CLPB, no oligómeros preamyloid remodelar o fibrillas de amiloide 26,31,32.
Ortólogos Hsp104 se encuentran en todos los reinos de la vida, excepto, sorprendentemente, los animales. En efecto, si las células animales poseen un sistema enzimático que desglose las parejas de proteínas para la renaturalización (en lugar de la degradación) sigue siendo desconocido 33-35. Por lo tanto, nosotros y otros han propuesto que Hsp104 podría ser desarrollado como un agente terapéutico para diversas enfermedades neurodegenerativas relacionadas con el mal plegamiento de proteínas específicas en oligómeros preamyloid tóxicos y fibrillas de amiloide 4,7,23,36-38. No existen tratamientos que afectan directamente a las especies agregados asociados a estas enfermedades. Sin embargo, se disuelve Hsp104 oligómeros tóxicos y fibrillas de amiloide compuesto de alfa-sinucleína, que se relacionan con la enfermedad de Parkinson 23, así como las formas de PrP-amiloide 39. Es importante destacar que Hsp104 reduce la agregación de proteínas y mejora la neurodegeneración en modelos de roedores de la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington 23 38. Lo ideal sería que, para optimizar el tratamiento y minimizar los efectos secundarios, Hsp104 sería diseñado y potenciado para remodelar de forma selectiva agregados específicos en el centro de la enfermedad en cuestión 4,7. Sin embargo, la limitada comprensión estructural y mecánica de cómo Hsp104 desagrega un repertorio diverso de las estructuras de agregados y proteínas no relacionadas frustra los esfuerzos 30,40-42.
Para comprender la estructura y el mecanismo de Hsp104, es esencial para el estudio de la proteína pura y reconstituir su actividad disaggregase con un mínimo de componentes. Hsp104 es una proteína con un pI 102kDa de ~ 5.3, que hexamerizes en presencia de ADP o ATP, o en las concentraciones de proteínas en ausencia de nucleótidos 43-46. Aquí se describe un protocolo optimizado para la purificación de la muy activa, estable Hsp104 de E. coli. El uso de E. coli permite simplificar en gran escala de producción y nuestro método se puede realizar de forma rápida y fiable para numerosos Hsp104 variantes. Nuestro protocolo aumenta Hsp104 pureza y simplifica 6-Su etiqueta de la eliminación en comparación con un método de purificación previa de E. coli 47. Por otra parte, el protocolo es más fácil y conveniente de dos protocolos más recientes 26,48.
Protocol
Discussion
Cronología: Para la máxima actividad Hsp104 se recomienda que el esquema de purificación se complete toda la mayor rapidez posible. Sin embargo, el número de etapas de purificación hace un exigente calendario que no siempre es práctico. Si las etapas de purificación se lleva a cabo lo más rápidamente posible, el tiempo desde el final de la expresión a través de la noche a la 02.04 horas de incubación a 30 ° C con TEV proteasa es de aproximadamente 9-11 horas. Un lugar potencial para hacer una pausa e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH (5T32GM008275-22) y la American Heart beca predoctoral Asociación (a EAS), un interfaz química-biología beca del NIH (2T32GM071339-06A1) (a MED), y subvenciones de la NIH (1DP2OD002177-01 y NS067354 0110), la Ellison Medical Foundation y la Fundación Bill y Melinda Gates (a JS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| BL21-CodonPlus-RIL Competent Cells | Stratagene, Agilent Technologies | 230255 |
| 2XYT broth | USB | 75864 |
| Complete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 1836170 |
| Pepstatin A | Sigma | P4265 |
| Ni-Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-02 |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter units (MWCO 30,000) | Millipore | UFC903008 |
| Resource Q – 6ml column | GE Healthcare | 17-1179-01 |
| proTEV Protease | Promega | V6052 |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575015 |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 |
| Hsp40 | Assay Designs | SPP-400 |
| Hsp72 | Assay Designs | ADI-NSP-555 |
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