Rening av Hsp104, ett protein Disaggregase
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för rening av mycket aktiva Hsp104, en hexameric AAA + protein från jäst, vilket par ATP hydrolys till protein uppdelning. Detta system utnyttjar en His6-märkta bygga för affinitet rening från<em> E. coli</em> Följt av anjon-utbyte kromatografi, His6-tagg borttagning med TEV proteas, och storlek-utanförskap kromatografi.
Abstract
Hsp104 är en hexameric AAA + protein 1 från jäst, vilket par ATP hydrolys till protein uppdelning 20-10 (bild 1). Denna verksamhet tillför två viktiga selektiva fördelar. Först ger Återställande av oordnade aggregat efter Hsp104 jäst överlevnaden efter olika protein-misfolding påkänningar, inbegripet heat shock 3,5,11,12. För det andra möjliggör ombyggnad av kors-beta amyloidfibrerna av Hsp104 jäst att utnyttja myriad prioner (smittsamma amyloid) som en reservoar av nyttiga och ärftlig fenotypisk variation 13-22. Anmärkningsvärt, remodels Hsp104 direkt preamyloid oligomerer och fibriller amyloid, inklusive de består av proteiner jäst prioner Sup35 och Ure2 23-30. Detta amyloid-remodeling funktionalitet är en specialiserad aspekt av jäst Hsp104. E. coli orthologue, ClpB, underlåter att oligomerer omskapa preamyloid eller fibriller amyloid 26,31,32.
Hsp104 orthologues finns i alla riken i livet utom perplexingly, djur. I själva verket, om djurceller har någon enzymatisk system som par protein uppdelning till Återställande (i stället för nedbrytning) är okänd 33-35. Därför har vi och andra föreslagit att Hsp104 kan utvecklas som ett terapeutiskt medel för olika neurodegenerativa sjukdomar i samband med misfolding av specifika proteiner i giftiga preamyloid oligomerer och fibriller amyloid 4,7,23,36-38. Det finns inga behandlingar som inriktas direkt på den aggregerade arter i samband med dessa sjukdomar. Ändå löser Hsp104 toxiska oligomerer och fibriller amyloid som består av alfa-synuklein, som har samband med Parkinsons sjukdom 23 liksom former amyloid av PrP 39. Viktigt minskar Hsp104 proteinaggregering och ameliorates neurodegeneration i gnagarmodeller av Parkinsons sjukdom 23 och Huntingtons sjukdom 38. Helst för att optimera behandlingen och minimera biverkningar, skulle Hsp104 vara konstruerad och förstärkas för att selektivt omforma särskilda aggregat central för sjukdomen i fråga 4,7. Men den begränsade strukturella och mekanistiska förståelsen för hur Hsp104 disaggregates en så mångfacetterad repertoar av aggregerade strukturer och oberoende proteiner hämmar dessa strävanden 30,40-42.
För att förstå struktur och mekanism Hsp104 är det viktigt att studera rent protein och rekonstruera dess disaggregase aktivitet med minimal komponenter. Hsp104 är en 102kDa protein med en PI på ~ 5,3, vilket hexamerizes i närvaro av ADP och ATP, eller vid hög proteinhalt koncentrationer i avsaknad av nukleotid 43-46. Här beskriver vi ett optimerat protokoll för rening av mycket aktiva, stabila Hsp104 från E. coli. Användningen av E. coli kan förenklas storskalig produktion och vår metod kan utföras snabbt och tillförlitligt för många Hsp104 varianter. Vår protokoll ökar Hsp104 renhet och förenklar Hans 6-tagg bort jämfört med en tidigare reningsmetod från E. coli 47. Dessutom är våra protokoll mer lättvindigt och bekvämt än två nyare protokollen 26,48.
Protocol
Discussion
Tidslinje: För maximal Hsp104 aktivitet rekommenderar vi att hela reningen systemet slutföras så snabbt som möjligt. Gör dock att antalet reningssteg ett krävande schema som inte alltid praktiskt. Om reningssteg genomförs så snabbt som möjligt, tiden från slutet av natten uttryck genom till 2-4 timmars inkubation vid 30 ° C med TEV proteas är cirka 9-11 timmar. En möjlig plats att pausa följer TEV klyvning steg. Om det är absolut nödvändigt kan Hsp104 vara knäppa frysas efter detta steg som besk…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH (5T32GM008275-22) och en American Heart Association predoctoral gemenskap (till EAS), en kemi-biologi Interface stipendium från NIH (2T32GM071339-06A1) (till MED), och bidrag från NIH (1DP2OD002177-01 och NS067354-0110), The Ellison Medical Foundation och Bill and Melinda Gates Foundation (till JS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| BL21-CodonPlus-RIL Competent Cells | Stratagene, Agilent Technologies | 230255 |
| 2XYT broth | USB | 75864 |
| Complete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 1836170 |
| Pepstatin A | Sigma | P4265 |
| Ni-Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-02 |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter units (MWCO 30,000) | Millipore | UFC903008 |
| Resource Q – 6ml column | GE Healthcare | 17-1179-01 |
| proTEV Protease | Promega | V6052 |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575015 |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 |
| Hsp40 | Assay Designs | SPP-400 |
| Hsp72 | Assay Designs | ADI-NSP-555 |
References
- Erzberger, J. P., Berger, J. M. Evolutionary relationships and structural mechanisms of AAA+ proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 93-114 (2006).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: A Novel Chaperone System that Rescues Previously Aggregated Proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88, 1-13 (2010).
- Parsell, D. A., Sanchez, Y., Stitzel, J. D., Lindquist, S. Hsp104 is a highly conserved protein with two essential nucleotide-binding sites. Nature. 353, 270-273 (1991).
- Doyle, S. M., Wickner, S. Hsp104 and ClpB: protein disaggregating machines. Trends Biochem Sci. 34, 40-48 (2009).
- Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16, 63-74 (2008).
- Glover, J. R., Lum, R. Remodeling of protein aggregates by Hsp104. Protein Pept Lett. 16, 587-597 (2009).
- Mogk, A., Haslberger, T., Tessarz, P., Bukau, B. Common and specific mechanisms of AAA+ proteins involved in protein quality control. Biochem Soc Trans. 36, 120-125 (2008).
- Grimminger-Marquardt, V., Lashuel, H. A. Structure and function of the molecular chaperone Hsp104 from yeast. Biopolymers. 93, 252-276 (2010).
- Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248, 1112-1115 (1990).
- Sanchez, Y., Taulien, J., Borkovich, K. A., Lindquist, S. Hsp104 is required for tolerance to many forms of stress. Embo J. 11, 2357-2364 (1992).
- Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137, 146-158 (2009).
- Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20, 125-1233 (2010).
- Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6, 435-450 (2005).
- True, H. L., Berlin, I., Lindquist, S. L. Epigenetic regulation of translation reveals hidden genetic variation to produce complex traits. Nature. 431, 184-187 (2004).
- True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407, 477-483 (2000).
- Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6, e294-e294 (2008).
- Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268, 880-884 (1995).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Epigenetics in the extreme: prions and the inheritance of environmentally acquired traits. Science. 330, 629-632 (2010).
- Satpute-Krishnan, P., Langseth, S. X., Serio, T. R. Hsp104-dependent remodeling of prion complexes mediates protein-only inheritance. PLoS Biol. 5, e24-e24 (2007).
- Sweeny, E. A., Shorter, J. Prion proteostasis: Hsp104 meets its supporting cast. Prion. 2, 135-140 (2008).
- Lo Bianco, C. Hsp104 antagonizes alpha-synuclein aggregation and reduces dopaminergic degeneration in a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 118, 3087-3097 (2008).
- Narayanan, S., Walter, S., Reif, B. Yeast prion-protein, sup35, fibril formation proceeds by addition and substraction of oligomers. Chembiochem. 7, 757-765 (2006).
- Savistchenko, J., Krzewska, J., Fay, N., Melki, R. Molecular chaperones and the assembly of the prion Ure2p in vitro. J Biol Chem. 283, 15732-15739 (2008).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304, 1793-1797 (2004).
- Shorter, J., Lindquist, S. Destruction or potentiation of different prions catalyzed by similar Hsp104 remodeling activities. Mol Cell. 23, 425-438 (2006).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70 and Hsp40 interplay regulates formation, growth and elimination of Sup35 prions. Embo J. 27, 2712-2724 (2008).
- Doyle, S. M. Asymmetric deceleration of ClpB or Hsp104 ATPase activity unleashes protein-remodeling activity. Nat Struct Mol Biol. 14, 114-122 (2007).
- Wendler, P. Atypical AAA+ subunit packing creates an expanded cavity for disaggregation by the protein-remodeling factor Hsp104. Cell. 131, 1366-1377 (2007).
- Hinault, M. P. Stable alpha-synuclein oligomers strongly inhibit chaperone activity of the Hsp70 system by weak interactions with J-domain co-chaperones. J Biol Chem. 285, 38173-38182 (2010).
- Tipton, K. A., Verges, K. J., Weissman, J. S. In vivo monitoring of the prion replication cycle reveals a critical role for Sis1 in delivering substrates to Hsp104. Mol Cell. 32, 584-591 (2008).
- Bieschke, J., Cohen, E., Murray, A., Dillin, A., Kelly, J. W. A kinetic assessment of the C. elegans amyloid disaggregation activity enables uncoupling of disassembly and proteolysis. Protein Sci1. 8, 2231-2241 (2009).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313, 1604-1610 (2006).
- Cohen, E. Reduced IGF-1 signaling delays age-associated proteotoxicity in mice. Cell. 139, 1157-1169 (2009).
- Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 23, 1191-11201 (2010).
- Carmichael, J. Bacterial and yeast chaperones reduce both aggregate formation and cell death in mammalian cell models of Huntington’s disease. Proc Natl Acad Sci. 97, 9701-9705 (2000).
- Vacher, C., Garcia-Oroz, L., Rubinsztein, D. C. Overexpression of yeast hsp104 reduces polyglutamine aggregation and prolongs survival of a transgenic mouse model of Huntington’s disease. Hum Mol Genet. 14, 3425-3433 (2005).
- Liu, Y. H. Heat Shock Protein 104 Inhibited the Fibrillization of Prion Peptide 106-126 and Disassembled Prion peptide 106-126 Fibrils in vitro. Int J Biochem Cell Biol. , (2011).
- Wendler, P., Saibil, H. R. Cryo electron microscopy structures of Hsp100 proteins: crowbars in or out. Biochem Cell Biol. 88, 89-96 (2010).
- Wendler, P. Motor mechanism for protein threading through Hsp104. Mol Cell. 34, 81-92 (2009).
- Lee, S., Sielaff, B., Lee, J., Tsai, F. T. CryoEM structure of Hsp104 and its mechanistic implication for protein disaggregation. Proc Natl Acad Sci. 107, 8135-8140 (2010).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Lindquist, S. Saccharomyces cerevisiae Hsp104 protein. Purification and characterization of ATP-induced structural changes. J Biol Chem. 269, 4480-4487 (1994).
- Schirmer, E. C., Queitsch, C., Kowal, A. S., Parsell, D. A., Lindquist, S. The ATPase activity of Hsp104, effects of environmental conditions and mutations. J Biol Chem. 273, 15546-15552 (1998).
- Schirmer, E. C., Ware, D. M., Queitsch, C., Kowal, A. S., Lindquist, S. L. Subunit interactions influence the biochemical and biological properties of Hsp104. Proc Natl Acad Sci. 98, 914-919 (2001).
- Hattendorf, D. A., Lindquist, S. L. Cooperative kinetics of both Hsp104 ATPase domains and interdomain communication revealed by AAA sensor-1 mutants. EMBO J. 21, 12-21 (2002).
- Schirmer, E. C., Lindquist, S. Purification and properties of Hsp104 from yeast. Methods Enzymol. 290, 430-444 (1998).
- Hattendorf, D. A., Lindquist, S. L. Analysis of the AAA sensor-2 motif in the C-terminal ATPase domain of Hsp104 with a site-specific fluorescent probe of nucleotide binding. Proc Natl Acad Sci. 99, 2732-2737 (2002).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J Biol Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Lum, R., Tkach, J. M., Vierling, E., Glover, J. R. Evidence for an unfolding/threading mechanism for protein disaggregation by Saccharomyces cerevisiae Hsp104. J Biol Chem. 279, 29139-29146 (2004).
- Tessarz, P., Mogk, A., Bukau, B. Substrate threading through the central pore of the Hsp104 chaperone as a common mechanism for protein disaggregation and prion propagation. Mol Microbiol. 68, 87-97 (2008).
- Weibezahn, J. Thermotolerance requires refolding of aggregated proteins by substrate translocation through the central pore of ClpB. Cell. 119, 653-665 (2004).
