Preparazione di Synaptoneurosomes da mouse Cortex con un discontinuo di Percoll-Saccarosio gradiente di densità
Summary
Un metodo per preparare traduzionali attivo, synaptoneurosomes intatto (SN) da topo corteccia cerebrale è descritto. Il metodo utilizza un discontinuo di Percoll-saccarosio gradiente di densità che permette per la preparazione veloce di SN attivo.
Abstract
Synaptoneurosomes (SN) si ottengono dopo omogeneizzazione e frazionamento della corteccia cerebrale del mouse. Sono risigillati vescicole o terminali isolati che rompere con terminali dell'assone quando il tessuto corticale è omogeneizzato. La SN mantengono caratteristiche di pre-e post-sinaptici, che li rende utili per lo studio della trasmissione sinaptica. Essi conservano le macchine molecolari utilizzati nella segnalazione neuronale e sono capaci di captazione, stoccaggio, e il rilascio di neurotrasmettitori.
La produzione e l'isolamento di SN attivo può essere problematico media usando come Ficoll, che possono essere citotossici e richiedono estese a causa di centrifugazione ad alta densità, e la filtrazione e metodi di centrifugazione, che può portare a bassa attività a causa di danni meccanici del SN. Tuttavia, l'uso discontinuo di Percoll-saccarosio gradienti di densità per isolare SN offre un metodo rapido per produrre buone rese di SN traduzionali attivo. Il Percoll-saccarosio metodo del gradiente è veloce e gentile come impiega condizioni isotoniche, ha un minor numero di giri centrifugazione e più brevi ed evita le fasi di centrifugazione che SN pellet e provocare danni meccanici.
Protocol
Discussion
Il discontinuo di Percoll-saccarosio preparazione pendenza qui descritto è un processo rapido, metodo affidabile per isolare attivo SN, che può essere utilizzato in una varietà di esperimenti di trasmissione sinaptica. Questo metodo del gradiente, che si basa sul metodo sviluppato da Dunkley et al. 3,4 è una procedura di frazionamento subcellulare del cervello che isola pre e post-sinaptici di membrana derivata vescicole che sono associati tra loro. Senza ulteriore purificazione queste SN sono compatibili…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare BK agosto presso la University of Wisconsin-Madison strumento microscopio elettronico per la microscopia elettronica. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01-DA026067 e P30-HD03352 (a JSM).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| CO2 gas | Airgas (UW-MDS) | CD 50 | |
| EDTA | RPI | E57020 | |
| EtOH | Fisher | A407SK-4 | |
| HCl | Fisher | A142-212 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | |
| PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit | Pierce | 89888 | |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-500 | |
| Na2PHO4 | Fisher | S381-500 | |
| Sucrose | RPI | S24060 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tetrodotoxin | Sigma | T5651 | |
| Express Pro Label Mix S35 Easy Tag | Perkin Elmer | NEG772 | |
| Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissection tools | |||
| Dounce homogenizer, 7 mL (comes with two glass pestles labled ” A” and “B”) | Wheaton | ||
| P1000 Gilson Pipetman | Gilson | F123602 | |
| Allegra 6KR Centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | |
| GH 3.8 Rotor, Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 360581 | |
| Beckman J2-21 Centrifuge | Beckman | ||
| Beckman tubes with caps | Beckman | 355672 | |
| White walled adapters | Beckman | 342327 | |
| Blue walled adapters | Beckman | ||
| JA-17 Rotor, Fixed-angle rotor | Beckman | 369691 |
Table of antibodies used for western blots:
| Name of Antibody | Company | Catalogue number | Host Species | Dilution Factor |
|---|---|---|---|---|
| β-Actin | Sigma | A5441 | mouse | 1:2000 |
| GFAP | Santa Cruz | sc-65343 | mouse | 1:200 |
| GP73 | Santa Cruz | Sc-134509 | rabbit | 1:200 |
| HSC70 | Santa Cruz | sc-7298 | mouse | 1:200 |
| Laminβ | Santa Cruz | Sc-6261 | goat | 1:200 |
| Prohibitin | Santa Cruz | sc-28259 | rabbit | 1:200 |
| PSD95 | Millipore | MAB1596 | mouse | 5 μg/μL |
| SNAP25 | AbCam | ab5666-100 | rabbit | 1:2000 |
| Synaptophysin | Millipore | MAB368 | mouse | 1:500 |
| β-3-Tubulin | Santa Cruz | sc-80016 | mouse | 1:200 |
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