ऑटोलॉगस endothelial पूर्वज सेल सीडिंग प्रौद्योगिकी और बड़े पशु मॉडल में हृदय उपकरणों के लिए biocompatibility परीक्षण

Summary

बोने टाइटेनियम के लिए एक विधि रक्त ऑटोलॉगस कोशिकाओं और परीक्षण biocompatibility के साथ biomaterials के संपर्क में वर्णित है. इस विधि में endothelial पूर्वज कोशिकाओं और टाइटेनियम ट्यूबों, सुअर का venae cavae में शल्य आरोपण के मिनट के भीतर वरीयता प्राप्त का उपयोग करता है. इस तकनीक को कई अन्य implantable जैव चिकित्सा उपकरणों के लिए अनुकूल है.

Abstract

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk of thromboemboli formation^1,2,3. We have developed a method to line the inside surface of Ti tubes with autologous blood-derived human or porcine endothelial progenitor cells (EPCs)⁴. By implanting Ti tubes containing a confluent layer of porcine EPCs in the inferior vena cava (IVC) of pigs, we tested the improved biocompatibility of the cell-seeded surface in the prothrombotic environment of a large animal model and compared it to unmodified bare metal surfaces^5,6,7 (Figure 1). This method can be used to endothelialize devices within minutes of implantation and test their antithrombotic function in vivo.

Peripheral blood was obtained from 50 kg Yorkshire swine and its mononuclear cell fraction cultured to isolate EPCs^4,8. Ti tubes (9.4 mm ID) were pre-cut into three 4.5 cm longitudinal sections and reassembled with heat-shrink tubing. A seeding device was built, which allows for slow rotation of the Ti tubes.

We performed a laparotomy on the pigs and externalized the intestine and urinary bladder. Sharp and blunt dissection was used to skeletonize the IVC from its bifurcation distal to the right renal artery proximal. The Ti tubes were then filled with fluorescently-labeled autologous EPC suspension and rotated at 10 RPH x 30 min to achieve uniform cell-coating⁹. After administration of 100 USP/ kg heparin, both ends of the IVC and a lumbar vein were clamped. A 4 cm veinotomy was performed and the device inserted and filled with phosphate-buffered saline. As the veinotomy was closed with a 4-0 Prolene running suture, one clamp was removed to de-air the IVC. At the end of the procedure, the fascia was approximated with 0-PDS (polydioxanone suture), the subcutaneous space closed with 2-0 Vicryl and the skin stapled closed.

After 3 – 21 days, pigs were euthanized, the device explanted en-block and fixed. The Ti tubes were disassembled and the inner surfaces imaged with a fluorescent microscope.

We found that the bare metal Ti tubes fully occluded whereas the EPC-seeded tubes remained patent. Further, we were able to demonstrate a confluent layer of EPCs on the inside blood-contacting surface.

Concluding, our technology can be used to endothelialize Ti tubes within minutes of implantation with autologous EPCs to prevent thrombosis of the device. Our surgical method allows for testing the improved biocompatibility of such modified devices with minimal blood loss and EPC-seeded surface disruption.

Protocol

1. Endothelial पूर्वज सेल अलगाव तीस दिनों पहले ईपीसी वरीयता प्राप्त ट्यूब आरोपण, anticoagulant साइट्रेट dextrose समाधान के 15 मिलीलीटर के साथ एक 60 मिलीलीटर सिरिंज तैयार और परिधीय सुअर रक्त से EPC अलगाव के लिए एक 3 – रास्ता बंद मुर्गा के साथ सुरक्षित. पहले रक्त आकर्षित precoat प्रकार एक चूहे (50 / μg मिलीलीटर, 0.02 एन एसिटिक एसिड समाधान में भंग) कोलेजन 4 के साथ दो प्लेटें 12-अच्छी तरह से 24 घंटे . नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ स्वास्थ्य प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए दिशानिर्देश के अनुसार में और देखरेख संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के बाद ही सभी जानवरों की देखभाल और प्रयोग आचरण. शांत Acepromazine के साथ एक महिला यॉर्कशायर (45 किलो) सुअर (1.1 मिलीग्राम / किग्रा) और Ketamine (22 मिग्रा / किग्रा) एक 19 जी तितली सुई के माध्यम से इंट्रामस्क्युलर. एक अंतःश्वासनलीय ट्यूब (30 सेमी लंबाई, 8 मिमी आईडी) के साथ सुअर Intubate और Isoflurane (मुखौटा द्वारा 4.5% ज्वार की मात्रा के) के साथ सुअर anesthetize. प्रक्रिया के दौरान ऑक्सीजन संतृप्ति, हृदय की दर और तापमान को मापने के द्वारा सुअर मॉनिटर. एक स्वचालित गरम ऑपरेटिंग मेज और हीटिंग कंबल का उपयोग करके और संचार तरल पदार्थ वार्मिंग द्वारा तापमान बनाए रखें. ऑपरेटिंग मेज पर लापरवाह स्थिति में सुअर प्लेस, अपनी हिंद अंग caudolaterally सुरक्षित, और DuraPrep नसबंदी द्वारा पीछा chlorhexidine के साथ स्वच्छ. फिर श्रोणि क्षेत्र draping के साथ आगे बढ़ना. एक 5 एफ सूक्ष्म introducer सिर्फ ऊरु नस में एक स्पर्शनीय ऊरु पल्स (vastus medialis औसत दर्जे का है और gracilis मांसपेशी के लिए पार्श्व) के लिए औसत दर्जे का किट से एक 21 जी x 7 सेमी सुई डालें और Seldinger तकनीक का उपयोग नस cannulate. Intravascular कैथेटर के लिए तैयार 60 मिलीलीटर सिरिंज कनेक्ट और रक्त की 45 मिलीलीटर आकर्षित. Hemostasis (5 मिनट) को प्राप्त करने के लिए पोत पंचर साइट पर दबाव पकड़ो, संज्ञाहरण बंद और सुअर पुनर्प्राप्त. जानवरों की पूरी वसूली तक नजर रखी है और अपने पिंजरे को लौट गया. हांक बफर नमक समाधान के साथ रक्त समाधान 1:01 (2 CaCl, 2 MgCl, 4 MgSO) के बिना और अच्छी तरह से परिभाषित परतों बनाने Histopaque के बराबर वॉल्यूम पर परत को पतला . अपकेंद्रित्र (30 मिनट, 740 जी, कम को तोड़ने सेटिंग) और जमा mononuclear (एमएनसी) सेल परत. Resuspend और है Dulbecco फास्फेट के साथ धोने बहुराष्ट्रीय कंपनियों 3 एक्स चढ़ाना पहले दो पूर्ण विकास मध्यम में 12 – अच्छी तरह प्लेटें (EBM-2 मध्यम 2% सुअर (पी एस) सीरम और ईजीएम – 2 के साथ में (DPBS) खारा (10 मिनट, 515 ग्राम) buffered 37 पर) SingleQuots ° सी, 5% सीओ 2. धीरे धीरे हर 24 घंटे पहले 7 दिनों के, तो हर दूसरे दिन के लिए मध्यम बदल जाते हैं. एक औसत समय के बाद EPC कालोनियों को पहचानें 7 दिन (चित्रा 2). संस्कृति में निर्यात संवर्धन परिषदों का विस्तार एक बार वे 12-अच्छी तरह से सतह क्षेत्र के ¼ कवर. प्रवाह cytometry के साथ सतह CD31 और अभाव CD14, CD45 मार्कर की उपस्थिति के लिए परीक्षण द्वारा ईपीसी पहचान की पुष्टि करें. अन्य assays कि प्रदर्शन किया जा सकता है सेल और चार प्रवाह के प्रदर्शन के बाद नाइट्रिक ऑक्साइड III गतिविधि आकारिकी शामिल हैं. 2. टाइटेनियम ट्यूब विधानसभा तिवारी ट्यूब एक 72 दांत HHS slitting के साथ longitudinally धारा 3 बराबर 120 डिग्री इकाइयों (4.5 सेमी लंबी) में जगह में एक ऊर्ध्वाधर मिलिंग मशीन में देखा कुंज द्वारा आयोजित देखा. यह 300 आरपीएम पर चलाने के लिए और काटने में कटौती के दौरान ठोकर जादू हर समय काटना द्रव (चित्रा 3) के साथ संतृप्त क्षेत्र रखना . एक बेंच ग्राइंडर और metalworking स्कॉच-Brite पहिया के साथ भीतरी सतह पॉलिश. तो मैन्युअल रूप से 3M एमरी आगे चिकनी और यहां तक ​​कि सतह कपड़े से पॉलिश हटाने के लिए किसी भी दिखाई गड्ढे. साफ Alconox साबुन समाधान के साथ तिवारी टुकड़े, 5 मिनट में डुबकी एक्वा regia (01:03 केंद्रित केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड नाइट्रिक एसिड), 10 पानी के कई लीटर के साथ rinsing के बाद अत्यधिक सावधानी व्यायाम. द्वारा पीछा के रूप में एक्वा regia बेहद संक्षारक है और संभावित विस्फोटक! Sonicate तिवारी वर्गों x Alconox साबुन समाधान में 16 मिनट, विआयनीकृत जल में x 30 जन्म और फिर x विआयनीकृत जल में 16 मिनट sonicate. लामिना का प्रवाह हुड में सूखे की अनुमति दें. कट पीवीसी गर्मी हटना 4.5 सेमी लंबाई और अच्छी तरह से 2.4 प्रति साफ करने के लिए टयूबिंग. चिमटी का प्रयोग करें एक सहायक (एल्यूमीनियम, 8.5 मिमी आयुध डिपो से machined) खराद का धुरा और तिवारी वर्गों के आसपास पीवीसी गर्मी टयूबिंग हटना (चित्रा 4) के स्थान पर आस्तीन पर 3 साफ तिवारी वर्गों जगह . एक गर्मी बंदूक के साथ टयूबिंग हटना जबकि खराद का धुरा ओर समान रूप से तिवारी वर्गों कसकर एक साथ लपेट. 3. सीडिंग डिवाइस और घटक विधानसभा 2.5 सेमी और 3.5 सेमी की लंबाई के लिए सिलिकॉन टयूबिंग कट. धारा 5 सीसी 0.8 मिलीलीटर निशान पर प्लास्टिक सिरिंज और luer अंत के साथ 'सर' टुकड़ा रखने. अच्छी तरह से 2 एक्स सिलिकॉन वर्गों, सिरिंज 'सिर टुकड़ा' और sonication के द्वारा एक luer टोपी के रूप में 2.4 के अंतर्गत वर्णित साफ . इकट्ठे तिवारी ट्यूब के प्रत्येक के अंत करने के लिए 2.5 से सिलिकॉन टयूबिंग जोड़ें Extenडिंग द्वारा पीवीसी टयूबिंग पर 5 मिमी. सम्मिलित सिरिंज कम सिलिकॉन टयूबिंग में सिर टुकड़ा 'के अंत में कटौती, ताकि यह तिवारी ट्यूब (चित्रा 5) abuts. सील Tyvek पाउच और ethylene ऑक्साइड (55 में 18 घंटे ° सी) के साथ गैस बाँझ में luer टोपी के साथ तिवारी ट्यूब विधानसभा समाप्त हो गया. एक Plexiglass मंच पर माउंट एक तुल्यकालिक समय मोटर (10 RPH) और एक सिरिंज धारक (एल्यूमीनियम का बाहर machined, 5 सीसी सिरिंज फिट बैठता है) (चित्रा 6) अपने एक्सल कनेक्ट. 4. तिवारी ट्यूब भीतरी सतह के EPC बोने निर्यात संवर्धन परिषदों का विस्तार के रूप में 1 के तहत पृथक 3 टी 75 बोतल मिला हुआ है (या कम से कम 9 एक्स 10 6 कोशिकाओं).. सर्जरी के दिन पर, दीर्घकालिक (PKH26) डाई 11 के साथ fluorescently लेबल कोशिकाओं. सुसंस्कृत निर्यात संवर्धन परिषदों सीरम मुक्त माध्यम में दो बार rinsing द्वारा शुरू करो. प्रकाश निवेश की सीमा के दौरान और लेबलिंग के बाद कोशिकाओं की रक्षा सावधानी. मंदक सी में 4 PKH26 सुक्ष्ममापी (डाई समाधान) 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर के साथ कोशिकाओं को कवर. बराबर मात्रा में सुअर का सीरम जोड़ने के लिए समाधान डाई द्वारा प्रतिक्रिया लेबलिंग बंद करो. एक मिनट बाद, पूर्ण मध्यम विकास के साथ संयुक्त 01:01 समाधान जलमिश्रित. तरल Aspirate और पूर्ण मध्यम विकास के साथ x 3 कोशिकाओं कुल्ला. निर्यात संवर्धन परिषदों DPBS में दो बार धो (2 CaCl, MgCl 2 के बिना) . 3 मिनट के लिए कवर trypsin और सेते में 37 कोशिकाओं ° सी और एक रोशनी खुर्दबीन के तहत टुकड़ी की पुष्टि. डबल trypsin की मात्रा का इस्तेमाल में trypsin निराकरण समाधान जोड़ें. एक एकल ट्यूब और मिश्रण में pipetting द्वारा सेल समाधान मिश्रण. Hemocytometer के प्रत्येक पक्ष में गिनती के लिए सेल के समाधान के 10 μl जोड़ें. अपकेंद्रित्र सेल समाधान (1500 RPH, 5 मिनट). 2 में कोशिकाओं और resuspend गोली गणना – सीरम मुक्त माध्यम में 2.5 x 10 6 निर्यात संवर्धन परिषदों / मिलीलीटर. नोट न्यूनतम मात्रा को भरने के लिए ट्यूब विधानसभा 4.5 मिलीलीटर है. बाँझ क्षेत्र के लिए जैविक हुड में बाँझ तौलिया बाहर लेटाओ. ओपन तिवारी ट्यूब और बाँझ क्षेत्र पर अतिरिक्त 5 सीसी सिरिंज विधानसभा गैस निष्फल. बाँझ दस्ताने के साथ, 5 सीसी सिरिंज से सवार को हटा दें और बाद में उपयोग के लिए मैदान पर रखने. प्रत्यय luer इस सिरिंज के लिए टोपी. Pipet 4.5 – 5 मिलीलीटर खुला सिरिंज बैरल में 4.9 के तहत ईपीसी निलंबन. सुरक्षित सिरिंज के खुले अंत में वापस सवार डालें. टोपी के साथ सिरिंज ऊपर की ओर पकड़ो और टोपी को हटा दें. Luer तिवारी ट्यूब विधानसभा के खुले सिलिकॉन टयूबिंग में पहली अंत के साथ सिरिंज सम्मिलित सुखद जब तक, तिवारी ट्यूब के भीतर अग्रिम नहीं करते. अग्रिम सिरिंज सवार धीरे धीरे जब तक सेल समाधान कटौती सिरिंज के ऊपर तक पहुँचता है सिस्टम से बुलबुले को हटाने 'सिर टुकड़ा,. Luer टोपी के साथ बंद करें और बाँझ म्यान में पूरे विधानसभा सम्मिलित करते हैं, टेप के साथ खुले अंत सील. 3.7 machined सिरिंज धारक में इस पूरे विधानसभा सम्मिलित करें. इनक्यूबेटर में 37 पर जगह डिग्री सेल्सियस और मंच तो बोने चैम्बर की है कि तिवारी ट्यूब भाग स्तर है, जल स्तर गेज (चित्रा 6) का उपयोग कर समायोजित. तिवारी ट्यूब विधानसभा आरोपण से पहले 30 मिनट बारी बारी से करने के लिए अनुमति दें. 5. तिवारी ट्यूब के सुअर अवर रग Cava में आरोपण चौबीस घंटे सर्जरी से पहले, एक fentanyl पैच (x 72 घंटे की जगह में पैच रखने 100 μg / transdermal घंटा) के साथ सुअर premedicate (जिसमें से निर्यात संवर्धन परिषदों अलग थे). सुअर NPO रात भर रखें और Baytril (Enrofloxacin) सर्जरी के दिन (5 मिग्रा / किग्रा, आईएम) और निम्नलिखित, एंटीबायोटिक प्रोफिलैक्सिस के रूप में हर 24 घंटे 7 दिनों के लिए प्रशासन preoperatively. शांत intubate, और सुअर anesthetize के रूप में 1.3 के अंतर्गत वर्णित (10 -15 मिलीग्राम / किग्रा का ज्वार मात्रा) और ऑपरेटिंग कमरे की मेज पर लापरवाह स्थिति में सुअर सुरक्षित है. प्रक्रिया के दौरान ऑक्सीजन संतृप्ति, हृदय की दर और तापमान को मापने के द्वारा सुअर मॉनिटर. एक स्वचालित गरम ऑपरेटिंग मेज और हीटिंग कंबल का उपयोग करके और संचार तरल पदार्थ वार्मिंग द्वारा तापमान बनाए रखें. सुअर के कान की नस में एक 18 जी चतुर्थ कैथेटर डालें और Vetropolycin आई ड्रॉप के साथ सुअर आंखों की रक्षा. स्वच्छ प्रस्तुत करने का, और 1.6 में के रूप में सुअर के पेट कपड़ा. # 15 स्केलपेल स्तन ग्रंथियों के 2 सेट से cranially 2 ब्लेड के लिए सेट caudally पिछले के साथ midline काटकर अलग कर देना. विच्छेदन electrocautery के साथ पेट प्रावरणी के नीचे कैर्री. मच्छर संदंश के साथ पेरिटोनियम लिफ्ट, और ध्यान से यह Metzenbaum कैंची के साथ प्रवेश. अमल मूत्राशय और मूत्राशय की दीवार में एक 3 हे Vicryl सीवन बटुआ स्ट्रिंग जगह. इसके बीच में एक चाकू चीरा प्लेस और एक 16 एफ Foley कैथेटर डालने. प्रशासन अंतःशिरा तरल पदार्थ (लैक्टेट Ringers) मूत्र उत्पादन टाइट्रेट /> = 1 मिलीग्राम / किग्रा / सर्जरी के दौरान घंटा. के बाद, छोटे और बड़े आंत्र और जगह दो Balfour शल्य peritoneal गुहा के पीछे पहलू का पर्दाफाश करने के लिए और अवर रग Cava (IVC) की पहचान retractors अमल में लाना. तेज और कुंद विच्छेदन ध्यान का प्रयोग, ऊतक आसपास से IVC मुफ्त और सही गुर्दे बाहर का IVC के बंटवारे को प्रॉक्सिमल धमनी से पोत पांडुलेख करना. IVC के विच्छेदन के दौरान चरम देखभाल व्यायाम भी IVC में एक बहुत छोटे दोष के रूप में तेजी से और जानवर की नकसीर exsanguination करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. IVC खंड के सभी पक्ष शाखाओं Ligate करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहाँ प्रत्यारोपित किया जा तिवारी ट्यूब के आसपास कोई खून बह रहा हो जाएगा. नोट आमतौर पर बड़े दो पीछे काठ नसों है कि बहुत सावधान विच्छेदन और ligation की आवश्यकता है. इसके अलावा, ध्यान दें कि तुरंत IVC के बंटवारे के लिए प्रॉक्सिमल, एक बड़े काठ नस सामान्यतः posteromedial तरफ सामना करना पड़ा है और दबाना प्लेसमेंट के लिए तैयारी में पोत loops के साथ मुक्त और नियंत्रित dissected होना चाहिए. तिवारी ट्यूब एक साथ के रूप में 4 के तहत उल्लिखित बोने के साथ आगे बढ़ें. 100 खासियत / हेपरिन किलो तुरंत IVC clamping के पहले प्रशासन. Distally IVC और काठ नस पर 45 डिग्री के कोण शल्य clamps रखें, और तब proximally. प्रॉक्सिमल और डिस्टल # 11 स्केलपेल Potts कैंची के साथ विस्तार से बाद ब्लेड का उपयोग clamps के बीच एक अनुदैर्ध्य veinotomy (4 सेमी) बनाएँ. IVC से किसी भी रक्त खाली और बाँझ DPBS के साथ अपने भीतर लुमेन फ्लश. अब IVC ​​में ईपीसी वरीयता प्राप्त तिवारी ट्यूब (या एक नंगे धातु नियंत्रण) सम्मिलित और यह (2 CaCl, MgCl 2 के साथ) DPBS सूखने से कोशिकाओं को रोकने के लिए और हवा खाली के साथ भरने. 4-0 Prolene चल सीवन के साथ veinotomy बंद करो और de हवा IVC वापस खून बह रहा है की एक छोटी राशि के माध्यम से एक प्रॉक्सिमल दबाना हटायें. पीवीसी टयूबिंग में नस दीवार के माध्यम से एक 'रहने के सिवनी' प्लेस करने के लिए समय के साथ प्रत्यारोपण के प्रवास को रोकने. हे पीडीएस के साथ एक सीटी सुई और उपचर्म अंतरिक्ष पर 2 हे Vicryl (sutures के चल रहा है) के साथ प्रावरणी बंद. स्टेपल के साथ त्वचा बंद करें. 0.25% (Bupivacaine) चीरा साइट के साथ subcutaneously Marcaine के 20 मिलीलीटर के लिए प्रशासन और धुंध और Tegaderm के साथ घाव को कवर. Subcutaneously के रूप में दर्द के लिए आवश्यक इसके अलावा Flunixin (2.2 मिलीग्राम / किग्रा क्यू 24 घंटे) और (4 घंटा 0.15 मिलीग्राम / किग्रा 3 क्यू) Oxymorphone दे. संज्ञाहरण बंद करने के लिए, जब तक जाग सुअर की निगरानी और पिंजरे पर लौटने. सुअर संकट / दर्द खड़े, और ambulation, मल और मूत्र उत्पादन, और त्वचा के रंग सामान्य छिड़काव का संकेत के संकेत के लिए दो बार दैनिक मॉनिटर. 6. तिवारी ट्यूब के Explantation 3 सप्ताह के बाद शांत intubate, और 1.3 में वर्णित सुअर anesthetize – 1.4. 5.8 – एक के रूप में 5.5 में वर्णित laparotomy के साथ आगे बढ़ें. नोट कि scarring प्रत्यारोपण साइट छिपाना होगा, लेकिन आप बगल में कठोर तिवारी ट्यूब टटोलना कर सकते हैं. बाहर के रूप में 5.9 में वर्णित IVC काटना – 5.11 और तिवारी ट्यूब IVC ​​भारी कैंची के साथ आसपास के साथ ब्लॉक explant . Euthasol इच्छामृत्यु समाधान की (390 मिलीग्राम / एमएल Pentobarbital सोडियम और 50 मिलीग्राम / एमएल 1 मिलीग्राम / 10 एलबीएस पर फ़िनाइटोइन सोडियम) के साथ पशु euthanize. 7. फिक्सेशन और इमेजिंग तिवारी भीतरी सतह Excised तिवारी ट्यूब के साथ DPBS समाधान में नस खंड कुल्ला और एक उच्च संकल्प डिजिटल कैमरा (चित्रा 7) के साथ अपने लुमेन (पेटेंट या occluded) तस्वीर . के बाद, डुबकी द्वारा 15 मिनट की एक न्यूनतम के लिए 3.7% paraformaldehyde में नमूना तय है. DPBS समाधान में नमूना कुल्ला. बहुत ध्यान से नस और पीवीसी टयूबिंग तिवारी ट्यूब को खोलने के आसपास काटकर अलग कर देना. 3 वर्गों के अंदर सतहों / 550 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के तहत प्रकाश स्रोत और छवि के उद्देश्य का सामना करना पड़ रहा लाल / नारंगी रंग (चित्रा 8A) में PKH26 – लेबल हुए निर्यात संवर्धन परिषदों कल्पना के साथ एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे रखें. अगर वांछित, कोशिकाओं को आगे सना हुआ हो (जैसे प्लेटलेट Endothelial सेल आसंजन मार्कर (PECAM कक्ष (चित्रा 8B) बॉर्डर, नाभिक कल्पना DAPI दाग, आदि कल्पना) दाग कर सकते हैं) . 8. प्रतिनिधि परिणाम: इस प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन के बाद, चिकित्सकों और वैज्ञानिकों के लिए ऑटोलॉगस रक्त व्युत्पन्न एक बड़े पशु मॉडल में endothelial पूर्वज कोशिकाओं के साथ ठोस ट्यूब संरचनाओं endothelialize सक्षम हैं चित्रा 2 से पता चलता है कि हमारी विधि के साथ अलग निर्यात संवर्धन परिषदों में 7 दिनों के बाद लगभग cobblestone आकारिकी के साथ कालोनियों के रूप में प्रकट संस्कृति. हमारे बोने आंकड़े 5 और 6 में सचित्र डिवाइस तिवारी बाँझ 9 शर्तों के तहत ईपीसी और ट्यूब के भीतरी सतह की वर्दी कवरेज में निलंबन के परिणाम के साथ भरा ट्यूबों की धीमी रोटेशन के लिए अनुमति देता है. हमारे आरोपण सर्जरी biomaterials के तिवारी जैसे, प्रवृत्ति के परीक्षण के लिए एक बड़े पशु मॉडल में घनास्त्रता के लिए अनुमति देता है. हमने पाया है कि सूअरों में इस प्रक्रिया को अच्छी तरह से और बर्दाश्त है कि इस आरोपण केवल न्यूनतम खून की कमी के साथ और ईपीसी परत व्यवधान के बिना हासिल किया जा सकता है. इसके अलावा, टी "> 7 चित्रा पता चलता है कि एक नंगे तिवारी ट्यूब पूरी तरह occludes, जबकि हमारे ईपीसी लाइन ट्यूब prothrombotic अवर रग Cava की कम कतरनी वातावरण में भी पेटेंट रहता है. fluorescently लेबल की कोशिकाओं के एक मिला हुआ परत की उपस्थिति की पुष्टि इस विधि की सफलता के रूप में 8 चित्रा में दिखाया गया है. चित्रा 1 ऑटोलॉगस endothelial पूर्वज सेल (ईपीसी) बोने के प्रयोग के योजनाबद्ध . पहले, परिधीय रक्त, एक सुअर से तैयार है. अगला, निर्यात संवर्धन परिषदों रक्त से अलग कर रहे हैं और संस्कृति में विस्तार. निर्यात संवर्धन परिषदों तो एक टाइटेनियम ट्यूब (तिवारी) डिवाइस, जो तब शल्य चिकित्सा एक ही सुअर है जो कोशिकाओं से अलग थे अवर रग Cava में प्रत्यारोपित लाइन के लिए उपयोग किया जाता है. चित्रा 2 संस्कृति में निर्यात संवर्धन परिषदों, अलगाव की प्रक्रिया के बाद लगभग 7 दिन (इमेजिंग कैमरा और QCapture सॉफ्टवेयर के साथ एक औंधा Leica DMIL खुर्दबीन के साथ imaged) के प्रतिनिधि कॉलोनी. चित्रा 3. तिवारी ट्यूब विधानसभा के लिए पहले वर्गों. तिवारी टयूबिंग longitudinally 3 बराबर वर्गों में कट जाता है, और फिर 4.5 सेमी लंबाई करने के लिए काट. तिवारी वर्गों के भीतरी सतहों दिखाई गड्ढे हटाने के लिए एक बेंच ग्राइंडर और एमरी कपड़े का उपयोग पॉलिश कर रहे हैं. चित्रा 4 तिवारी ट्यूब वर्गों के पीवीसी गर्मी हटना (नीला) टयूबिंग और गर्मी बंदूक के साथ विधानसभा . तिवारी वर्गों एक machined एल्यूमीनियम खराद का धुरा है जो तिवारी वर्गों के माध्यम से फैली है और तिवारी ट्यूब भीतरी व्यास के आयामों से मेल खाता है पर समर्थित हैं. 5 चित्रा टाइटेनियम ट्यूब विधानसभा, सभी घटकों को दर्शाता है: luer टोपी, सिरिंज 'सिर टुकड़ा,' सिलिकॉन टयूबिंग, और पीवीसी लपेटो (नीले) के साथ तिवारी ट्यूब. विधानसभा एक साथ रखा है शल्य चिकित्सा उपयोग के लिए नसबंदी करने से पहले. चित्रा 6 तिवारी इनक्यूबेटर अंदर ट्यूब बोने स्थापना, मोटर, मंच दिखा, machined एल्यूमीनियम सिरिंज धारक, तिवारी ट्यूब विधानसभा, और 5 सीसी सिरिंज. नोट: विधानसभा दृश्य प्रयोजनों के लिए सुरक्षात्मक बाँझ म्यान के बिना दिखाया गया है. 7 चित्रा आरोपण सर्जरी के प्रतिनिधि सकल परिणाम. (ए) सुअर का अवर रग Cava (IVC) में आरोपण के बाद नियंत्रण नंगे धातु तिवारी ट्यूब के अंत देखने. ट्यूब लुमेन पूरी तरह से एक ठोस थक्का के साथ occluded है (बी) ईपीसी वरीयता प्राप्त तिवारी ट्यूब के अंत देखने के आरोपण के बाद. ट्यूब लुमेन पूरी तरह से पेटेंट और स्पष्ट (सी) नियंत्रण के dissected दृश्य (नंगे) तिवारी ट्यूब है. 3 दिन के आरोपण के बाद, घनास्त्रता (प्रयोगों समान परिणामों के साथ 3 सप्ताह की अवधि के लिए आयोजित की गई) की हद तक दिखा. तिवारी ट्यूब की सतह पर 3 दिन के आरोपण के बाद 8 चित्रा. निर्यात संवर्धन परिषदों (QImaging QICAM के साथ एक ईमानदार Leica DMRB खुर्दबीन के साथ imaged डिजिटल कैमरे और छवि प्रो प्लस सॉफ्टवेयर मोनोक्रोम). (ए) सतह पर मिला हुआ कोशिकाओं PKH26 लेबलिंग पूर्व सर्जरी दिखा. निर्यात संवर्धन परिषदों के (बी) मिला हुआ परत. लाल: PKH26 पूर्व सर्जरी लेबलिंग. ग्रीन: ईपीसी PECAM दाग.

Discussion

सेल बोने तिवारी ट्यूबों यहाँ प्रस्तुत की विधि चिकित्सकों और वैज्ञानिकों के लिए सक्षम बनाता है जल्दी और समान endothelialize रक्त संपर्क implantable उपकरणों की सतहों. के बाद से हम अलग और परिधीय रक्त के नमूनों से निर्यात संवर्धन परिषदों का विस्तार करने के लिए, कोई बड़ी इनवेसिव प्रक्रिया के लिए इन कोशिकाओं को फसल के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, निर्यात संवर्धन परिषदों ऑटोलॉगस हैं, इसलिए प्रत्यारोपण सेल – वरीयता प्राप्त करने के लिए किसी भी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का खतरा समाप्त हो रहा है. अपने प्रोटोकॉल में प्रदर्शन सिद्धांतों को न केवल तिवारी ट्यूबों के लिए, लेकिन कई अन्य biomaterials, जो हृदय चिकित्सा में उपयोग किया जाता है के लिए उपयोग किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल में गंभीर कदम तिवारी ट्यूबों के सावधानीपूर्वक सफाई कर रहे हैं, के रूप में हमने पाया कि contaminant समझौते सेल पालन के किसी भी पक्षपाती फिल्म. इसके अलावा, एक धीमी गति से घूर्णन गति (inversely ट्यूब व्यास के समानुपाती) बोने की प्रक्रिया के दौरान आवश्यक है, कि इस तरह के निर्यात संवर्धन परिषदों धीरे से व्यवस्थित करने और के सतह का पालन तिवारी ट्यूब के रूप में बढ़ रहा है कर सकते हैं.

आरोपण से पहले तुरंत बोने की हमारी विधि अव्यावहारिक पूर्व vivo संस्कृति बार से बचा जाता है, व्यक्तिगत कोशिकाओं का पालन करना और बाद vivo में मिला हुआ पत्रक के रूप में, एक पत्र के रूप में तुरंत प्रवाह की पुनः स्थापना के बाद embolization की संभावना से बचने. हमारे पहले के अध्ययनों से पता चलता है कि एक बार निर्यात संवर्धन परिषदों मिला हुआ परत करने के लिए हो गए हैं, वे एक अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स है जो वे दृढ़ता से पालन करते हैं, अतिरिक्त कम से कम एक endothelial पत्रक के किसी भी संभव sloughing. हालांकि embolic टुकड़ी की संभावना पूरी तरह से बाहर नहीं शासन कर सकते हैं, यह पूरे डिवाइस सतह के घनास्त्रता से मुख़्तलिफ़ कम जोखिम है, समस्या यह है कि इस थेरेपी को रोकने के लिए डिज़ाइन किया गया है लगता है.

कम कतरनी में हमारी आरोपण के दृष्टिकोण, अवर रग Cava prothrombotic पर्यावरण रक्त संगतता और ^5,6 उपकरणों के घनास्त्रता शोध के लिए सबसे भरोसेमंद बड़े पशु मॉडल में से एक का इस्तेमाल. ध्यान दें कि सभी जानवरों की देखभाल और प्रयोग के राष्ट्रीय संस्थान स्वास्थ्य प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए दिशानिर्देश के साथ और केवल ड्यूक विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के बाद अनुसार आयोजित किया गया.

आदेश में सफलतापूर्वक इस आरोपण विधि का उपयोग करने के लिए biomaterials और उपकरणों का परीक्षण, यह महत्वपूर्ण है धैर्य IVC खंड पांडुलेख करना और तैयारी में डिवाइस प्रविष्टि के लिए सभी शिरापरक शाखा वाहिकाओं, ऐसी है कि डिवाइस के आसपास कोई खून बह रहा एक 'झूठी लुमेन' में originates ligate. एक अन्य महत्वपूर्ण कदम डिवाइस ऐसी है कि अंदर ट्यूब की सतह पर कोशिकाओं veinotomy के बंद के दौरान नम रहते हैं और पहले reperfusion शुरू की है लुमेन में DPBS के अलावा है. यदि डिवाइस स्थान है जहाँ इसे प्रत्यारोपित किया गया था में पाया नहीं जा सकता, यह IVC में 'अपस्ट्रीम' माइग्रेट हो सकता है. पीवीसी टयूबिंग 3 मिमी अनुभाग इतना है कि ट्यूब मजबूती से अपने वर्तमान स्थान में लंगर डाले है – यह नस दीवार के माध्यम से और एक 2 के माध्यम से एक सिवनी (4 हे Prolene) रखकर रोका जा सकता है. शोधकर्ता fluorescently पूर्व लेबल एक अन्यथा पेटेंट ट्यूब में explantation होने के बाद 8 चित्रा में दिखाया गया है कोशिकाओं को खोजने में कठिनाई है, यह संभावना है कि कोशिकाओं से एक सुसंगत पत्रक के रूप में खुली है. यह आसपास के और 3 तिवारी ट्यूब वर्गों के नस जिले विधानसभा की बहुत कोमल विच्छेदन के द्वारा रोका जा सकता है ट्यूब के साथ एक साथ नस फिक्सिंग के बाद.

हमारी प्रौद्योगिकी ईपीसी – बोने के माध्यम से हृदय युक्ति घनास्त्रता रोकने के लिए सबूत की अवधारणा के प्रदान करता है. यह तकनीक 'biogenic' मरीजों के अपने endothelial पूर्वज कोशिकाओं के साथ पंक्तिवाला प्रत्यारोपण के विकास में इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारे सुअर पशु मॉडल में व्यवहार्यता अध्ययन इस 'व्यक्तिगत दवा' के नैदानिक ​​व्यवहार में अनुवाद की ओर पहला कदम के लिए प्रदान करता है.

Materials

Reagent	Company Name	Catalogue Number	Comments
Acepromazine	Boehringer-Ingelheim	BIC670025	NAC# 10280002
Alconox Powered Precision Cleaner	Alconox	1104
Balfour Surgical Retractor	Adler	N/A
Baytril	Bayer	APVMA 46028/0705
Butterfly Needle (19G)	Terumo	SV19CLK
Chlorhexidine	3M	9200
Clamps (45-degree)	Aesculap	FC339T
DPBS (-/-)	Gibco	14190-144
DPBS (+/+)	Gibco	14040-133
DuraPrep	3M	8635
EBM-2 Medium	Lonza	CC-3156	Base for both serum free and full growth medium
EGM-2 SingleQuots	Lonza	CC-3162	Used with EBM-2 for both serum free and full growth medium
Electrocautery Tool	Valleylab	SurgII-20
Emery Cloth	3M	60-0700-0425-8	240 grit
Euthasol Euthanasia Solution	Virback Animal Health		ANADA #: 200-071
Fentanyl Patch	Actavis		NDC # 67767-120-18
Flunixin	Schering-Plough		NAC #: 10470183
Foley Catheter (16F)	Bard	730116
HBSS	Sigma	H8264-500ML
Heat Gun	Milwaukee	8988-20
Heparin			NDC #: 25021
Histopaque-1077	Sigma	H8889-500ML
Intubation Tube	Mallinckrodt	86113
Isoflurane	MWI, Meridian		NDC #13985-030
IV Catheter (18G)	Becton-Dickinson	381547
Ketamine	Fort Dodge		NDC #0856-2013
Level	Swanson	LLA001
Luer-Lock tip cap	CML Supply	909-001
Marcaine	Hospira		NDC #: 0409-1560-10
Metzenbaum Scissors	Adler	N/A
Micro-introducer (5F)	Galt	KIT 002-01
Mosquito Forceps	Adler	N/A
Motor	Herbach and Rademan	H1-08
Oxymorphone	Endo Labs		NDC: 63481-624-10
PKH26 Dye Kit	Sigma	PKH26GL-1KT
Porcine Serum	Gemini Bio-Products	100-115	2% concentration in full growth medium
Potts Scissors	Adler	N/A
Precise Vista Skin Stapler	3M	3998
PVC Tubing	McMaster-Carr/Insultab	7132K117	expanded ID 15.88 mm, recovered ID 7.95 mm
Right Angle Medium Size	Adler	N/A
Scalpel Blade (#10-15)	Bard	373910
Silicone Tubing	McMaster-Carr	51735K26	16.64 mm OD, 9.52 mm ID
Syringe (5 cc)	Becton-Dickinson (BD)	309603
Tegaderm	3M	90001
Three-way Stopcock	Kendall	170060
Ti Tube	Tico Titanium	N/A	Specified as ½” OD, .065″ wall, .370″ ID, .1737 lbs/ft
Trypsin	Lonza	CC-5012
Trypsin Neutralizing Solution (TNS)	Lonza	CC-5002	0.03%
Vetropolycin	Pharmaderm Animal Health		NAC #: 12920110
Vicryl Suture (3-0)	Ethicon	J808T
Water Bath Sonicator	Branson	B200