Isolering av primära celler Mus trofoblaster och trofoblaster Invasion Assay

Summary

I detta protokoll beskriver vi dissektion av efterbörd från musen om graviditet d10.5, följt av isolering av trofoblastceller med en Percoll-gradient. Vi visar då användning av de isolerade cellerna i en Matrigel invasion assay.

Abstract

Moderkakan är ansvarig för transporten av näringsämnen, gaser och tillväxtfaktorer till fostret, liksom eliminering av avfall. Således brister i placenta utveckling har viktiga konsekvenser för fostret och modern, och är en viktig orsak till embryonal dödlighet. Den stora celltyp av fostrets del av moderkakan är trofoblaster. Primära mus placentala trofoblastceller är ett användbart verktyg för att studera normal och onormal moderkakan utveckling, och till skillnad cellinjer, kan isoleras och användas för att studera trofoblaster i vissa stadier av graviditeten. Dessutom kan primära kulturer av trofoblaster från transgena möss användas för att studera rollen av specifika gener i placentaceller. Protokollet som presenteras här är baserat på beskrivningen av Thordarson et al. ^1, i vilken en Percoll-gradient används för att erhålla en relativt ren population trofoblast cell från mus isolerade moderkakor. Det liknar mer allmänt användad metoder för mänsklig trofoblaster cellisolering ^2-3. Renhet kan bedömas genom immunocytokemisk färgning av de isolerade cellerna för cytokeratin 7 ^4. Här är de isolerade cellerna analyserades sedan med användning av en Matrigel invasion analys för att bedöma trofoblast invasivitet in vitro ^5-6. De invaderade cellerna analyseras med immuncytokemi och färgas för räkning.

Protocol

1. Dissektion av mus moderkakan Ställ in passande par möss. På vart och ett av de följande dagarna, kontrollera närvaron av en copulatory plugg. Den dag då en plugg upptäcks anses 0,5 dagar efter samlag (DPC) 7. Moderkakor kan samlas vid den önskade skede av graviditeten, med en ren dissektion av moderkakan möjliga börjar med utvecklingen av den mogna moderkakan på d. 10,5. Här visar vi 14,5 DPC. Vid givna volymer, kommer 40-60 moderkakor på 10,5 DP…

Discussion

I den här videon visar vi isolering av trofoblastceller från musen moderkakan. Vi visar en in vitro-analys för trofoblast invasion. Med användning av denna procedur, till stor del en, men inte helt, kan ren population av trofoblastceller erhållas. Om ytterligare renhet krävs, kan magnetiska pärlor separation eller flödescytometri utföras, såsom har beskrivits för primära humana trofoblastceller. Rätt längd på kollagenas dissociationssteget måste bestämmas med varje experiment, och kommer att lära med e…

Materials

Specific reagents and equipment:

Wash Solution (filter sterilize after mixing)

Reagent	Amount	Final concentration
10x Medium 199	50ml	1X
Hepes	2.383 g	0.02M
sodium bicarbonate	0.42 g	0.01M
Penicllin-Streptomycin	5 mL	100 U- 100 μg /ml
Sterile dH20	to 500 mL

Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)

Reagent	Amount	Final concentration
Wash Solution	100 mL
DNase	1 vial (2000 U)	20 U/mL
Collagenase	100 mg	125 digestion units/mL

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Collagenase	Sigma	C9891	This is Clostridium collagenase. Bovine pancreatic collagenase would likely work as well
NCTC-135	Sigma	D4263	Add FBS to 10%
Matrigel invasion chambers	BD Biosciences	354481
10x Medium 199	Sigma	M9163
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140
DNase	Sigma	D4263
100 μm Cell strainer	Fisher	22363549
Antibody to cytokeratin 7	DAKO	M7018	Used at 1:100 dilution

Equipment
Standard cell culture equipment including a CO₂ incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.