高活性酵母核糖体的色谱分离纯化
Summary
准备用传统的方法，纯化共同净化核酸酶和蛋白酶的真核细胞的核糖体的污染造成了消极影响下游的生化和结构分析。一个快速和简单的色谱的净化方法是用来解决这个问题作为一个模型系统中使用的酵母核糖体。
Abstract
真核生物核糖体相比，他们真细菌和archael更加不稳定，从而构成了重大挑战，研究人员。特别麻烦的是，细胞溶解释放大量的蛋白酶和核酸，这可以降低核糖体。因此，重要的是尽可能快地从这些酶中分离出来的核糖体。不幸的是，传统的差分离心方法叶时间不可接受的长期接触这些酶的核糖体，影响其结构的完整性和功能。为了解决这个问题，我们利用一个色谱法使用收费Sulfolink树脂半胱氨酸。这个简单，快速的应用显着降低水解蛋白和nucleolytic活动，共同净化生产完好，高度生化活性酵母核糖体的高产量。我们建议，这种方法也应适用于哺乳动物的核糖体。简约的方法，增强的纯度和色谱纯化的核糖体的活动的一个显著的技术进步，为真核细胞的核糖体的研究。
Protocol
1。半胱氨酸负责筹备Sulfolink树脂准备Sulfolink树脂（皮尔斯）在室温下。 广场共10毫升50％的Sulfolink耦合两个10毫升的塑料瓶制造商提供的凝胶浆，分发到每个小瓶5毫升。 短暂离心瓶850 XG，小心取出上清液。 耦合缓冲冲洗凝胶3次（50毫米三，pH值8.5，5毫米EDTA）resuspending在5毫升的珠子，离心850简要XG和消除吸取上清液。 每管添加50毫米的L -半胱氨酸耦合缓冲溶液5?…
Discussion
核糖体净化协议主要涉及裂解细胞，收获一个细胞质分数从低转速旋转，然后造粒核糖体由高速离心1。虽然提出了一些新颖的方法已被用于净化细菌核糖体，同样没有被真正的真核生物2-4。虽然这些年来，例如盐清洗和甘油垫子（如看到5）增加额外的步骤，酵母核糖体的生化和结构的研究已阻碍了他们的倾向，成为在净化过程中的内源性降解酶降解，最有可能由于长期?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们衷心感谢Dinman实验室的所有成员，包括阿什顿Belew，莫文蔚杰克，Sharmishtha Musalga，谢尔盖Sulima，Shivani雷迪，他们的帮助和在这个项目上的投入和Michael Rhodin。这项工作得到了补助金，上午由美国心脏协会（AHA 0630163N）和开发部的国立卫生研究院（5R01 GM058859 – 12）。日航是支持美国再投资和恢复法案2009年补充父补助金（3R01GM058859 11S1）。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce | 20402 |
| Mini bead-beater 16 | Biospec | 607 |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Legend RT | Sorvall | |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec | 11079105 |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 |
| GTP | Fermentas | R0461 |
References
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
- Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
- Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
- Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
- Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
- Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
- Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
- Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
- Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
- Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
- Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
- Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Biochimie. 15, 2289-2296 (1976).
Tags
Chromatographic PurificationYeast RibosomesLabile RibosomesProteasesNucleasesDifferential UltracentrifugationStructural IntegrityFunctionalityCysteine Charged Sulfolink ResinCo-purifying Proteolytic And Nucleolytic ActivitiesIntact RibosomesBiochemically Active RibosomesMammalian RibosomesTechnical Advancement
Citer Cet Article
Meskauskas, A., Leshin, J. A., Dinman, J. D. Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes. J. Vis. Exp. (56), e3214, doi:10.3791/3214 (2011).