Purificação cromatográfica de Ribossomos Yeast Highly Active
Summary
Contaminação de preparações dos ribossomos eucarióticos purificado por métodos tradicionais de co purificação de proteases e nucleases negativamente impactos sobre a jusante análises bioquímicas e estruturais. Um método de purificação cromatográfica rápida e simples é usado para resolver esse problema usando os ribossomos de levedura como um sistema modelo.
Abstract
Ribossomos eucarióticos são muito mais instável, em comparação com os seus homólogos eubacterianas archael e, desta forma criando um grande desafio para os pesquisadores. Particularmente problemático é o fato de que a lise de células libera um grande número de proteases e nucleases que podem degradar os ribossomos. Assim, é importante separar os ribossomos a partir destas enzimas o mais rápido possível. Infelizmente, os métodos convencionais ultracentrifugação diferencial deixa ribossomos expostos a estas enzimas por períodos inaceitavelmente longos de tempo, afetando sua integridade estrutural e funcionalidade. Para resolver este problema, nós utilizamos um método de cromatografia usando uma cisteína cobrado Sulfolink resina. Esta aplicação simples e rápido reduz significativamente co purificação de atividades proteolíticas e nucleolytic, produzindo altos rendimentos de intacto, ribossomos de levedura altamente bioquimicamente ativas. Sugerimos que este método também deve ser aplicável a ribossomos de mamíferos. A simplicidade deo método ea pureza maior e atividade do ribossomo purificada cromatograficamente representa um avanço técnico significativo para o estudo dos ribossomos eucarióticos.
Protocol
Discussion
Protocolos de purificação de ribossomo basicamente envolvem as células de lise, colhendo uma fração citosólica de uma rotação baixa velocidade, e depois de granulação ribossomos por centrifugação de alta velocidade 1. Enquanto uma novela poucos métodos têm sido utilizados para a purificação ribossomos bacterianos, o mesmo não tinha sido verdade para eucariontes 2-4. Embora as etapas foram adicionadas ao longo dos anos, lava o sal por exemplo, almofadas e glicerol (por exemplo, ver …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer a todos os membros do laboratório Dinman, incluindo Ashton Belew, Jack Karen, Musalga Sharmishtha, Sulima Sergey, Reddy Shivani, e Michael Rhodin pela sua ajuda e de entrada neste projeto. Este trabalho foi suportado por concessões de AM da American Heart Association (AHA 0630163N) e JDD do National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL foi apoiada por um americano e Reinvestimento Lei de Recuperação de 2009 suplemento para a concessão dos pais (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce | 20402 |
| Mini bead-beater 16 | Biospec | 607 |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Legend RT | Sorvall | |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec | 11079105 |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 |
| GTP | Fermentas | R0461 |
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