Kromatografiska Rening av högaktiv Jäst Ribosomer
Summary
Förorening av beredningar av eukaryota ribosomer renas med traditionella metoder av samtidig renande nukleaser och proteaser en negativ inverkan på nedströms biokemiska och strukturella analyser. En snabb och enkel kromatografisk rening metoden används för att lösa detta problem med hjälp av jäst ribosomer som modellsystem.
Abstract
Eukaryota ribosomer är mycket mer instabil jämfört med deras färgas eubakteriecellerna och archael motsvarigheter, vilket utgör en betydande utmaning för forskarna. Särskilt besvärande är det faktum att lys av celler släpper ett stort antal proteaser och nukleaser som kan försämra ribosomer. Därför är det viktigt att skilja ribosomer från dessa enzymer så snabbt som möjligt. Tyvärr lämnar konventionell differential ultracentrifugering metoder ribosomer utsatta för dessa enzymer för oacceptabelt lång tid, vilket påverkar deras strukturella integritet och funktionalitet. För att lösa detta problem använder vi en kromatografisk metod med en cystein laddat Sulfolink harts. Detta enkla och snabba användning minskar betydligt samtidigt renande proteolytiska och nucleolytic aktiviteter, producera hög avkastning av intakta, mycket biokemiskt aktiv jäst ribosomer. Vi föreslår att metoden också ska tillämpas på däggdjur ribosomer. Enkelheten imetoden och den förbättrade renhet och aktivitet kromatografiskt renat ribosomen utgör en betydande tekniska framsteg för studiet av eukaryota ribosomer.
Protocol
Discussion
Ribosomen rening protokoll innebär i grunden lyserings celler, skörda ett cytosoliskt fraktionen från en låg hastighet spinn och sedan pelletering ribosomer med hög hastighet centrifugering 1. Medan några nya metoder har använts för att rena bakteriella ribosomer, hade samma inte varit sant för eukaryoter 2-4. Trots att ytterligare steg har lagts till under åren, t ex tvättar salt och kuddar glycerol (se t.ex. 5), har biokemiska och strukturella studier av jäst ribosomer har …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka alla medlemmar i Dinman laboratoriet, inklusive Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, och Michael Rhodin för deras hjälp och synpunkter på detta projekt. Detta arbete har finansierats med bidrag till AM från American Heart Association (AHA 0630163N) och JDD från National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL fick stöd av en amerikansk Reinvestment och Recovery Act av 2009 komplement till den förälder bidraget (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce | 20402 |
| Mini bead-beater 16 | Biospec | 607 |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Legend RT | Sorvall | |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec | 11079105 |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 |
| GTP | Fermentas | R0461 |
References
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
- Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
- Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
- Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
- Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
- Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
- Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
- Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
- Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
- Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
- Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
- Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Biochimie. 15, 2289-2296 (1976).
