Eine einfache, schnelle Methode zur Bestimmung der Verzuckerung Potenzial einer großen Zahl von pflanzlicher Biomasse Proben beschrieben. Die automatisierte Plattform für diese Analyse umfasst die Vorbereitung der pflanzlichen Biomasse für die Analyse in 96-Well-Platten und die anschließende Performance der Vorbehandlung, Hydrolyse und Quantifizierung der Zucker freigesetzt.
Polysaccharide, aus denen sich Pflanzen Lignozellulose aufgeschlüsselt werden können, um eine Reihe von Zuckern, die später bei der Errichtung einer Bioraffinerie eingesetzt werden können produzieren. Diese Rohstoffe wäre eine neue industrielle Plattform, die sowohl nachhaltig als auch klimaneutral ist, um die derzeitige Abhängigkeit von fossilen Brennstoffen zu ersetzen. Die Widerspenstigkeit der Dekonstruktion in Lignocellulose-Materialien beobachtet wird von mehreren intrinsischen Eigenschaften der pflanzlichen Zellwände produziert. Kristalliner Cellulose ist in Matrix-Polysaccharide wie Xylane und Arabinoxylane eingebettet, und die ganze Struktur ist umhüllt von der phenolischen Polymer Lignin, das ist auch schwierig zu 1 zu verdauen. Um die Verdaulichkeit von pflanzlichen Materialien, die wir benötigen, um die wichtigsten Engpässe für die Verzuckerung der Zellwände und auch Bildschirm-Mutante und Populationen zu entdecken, um die Variabilität in Verzuckerung 2 auszuwerten verbessern. Diese Aufgaben erfordern einen hohen Durchsatz Ansatz und hier präsentieren wir eine analytische Plattform, die Verzuckerung Analyse in einer 96-Well-Platte-Format durchführen können. Diese Plattform wurde entwickelt, um das Screening von Lignocellulose Verdaulichkeit von großen Populationen von verschiedensten Pflanzenarten ermöglichen. Wir haben den Reaktionsvolumina für die schonende Vorbehandlung, partielle enzymatische Hydrolyse und Zuckerbestimmung skaliert, damit eine große Zahl schnell in ein automatisiertes System beurteilt werden.
Diese vollautomatische Plattform arbeitet mit Milligramm-Mengen von Biomasse, die Durchführung Kugelmühle unter kontrollierten Bedingungen, um die pflanzlichen Materialien zu einem standardisierten Partikelgröße in reproduzierbarer Weise zu reduzieren. Sobald die Proben Boden sind, verzichtet die automatisierte Formatierung Roboter angegeben und erfasst Mengen an Material in die entsprechenden Vertiefungen der 96-well-Platte (Abbildung 1). Normalerweise verzichten wir aus dem gleichen Material in 4 Vertiefungen zu haben 4 Wiederholungen für die Analyse. Sobald die Platten mit dem Pflanzenmaterial in das gewünschte Layout gefüllt sind, werden sie manuell in einen Liquid-Handling-Station (Abbildung 2) bewegt. In dieser Station werden die Proben auf eine milde Vorbehandlung entweder mit verdünnter Säure oder alkalischen unterzogen und über Nacht bei Temperaturen von bis zu 90 ° C. Die Vorbehandlung Lösung wird anschließend entfernt und die Proben werden mit Puffer gespült, um sie zu einem geeigneten pH-Wert für die Hydrolyse zurückzukehren. Die Proben werden dann mit einem Enzym-Gemisch für eine variable Länge der Zeit bei 50 ° C inkubiert Ein Aliquot wird aus dem Hydrolysat entnommen und der reduzierenden Zucker werden automatisch von der MBTH kolorimetrischen Methode bestimmt.
Variations of the standard saccharification protocol can be used in the same platform for determining the activity of cellulolytic enzymes (i.e. by variation of the enzyme concentrations used in a plate as well as using paper as substrate); comparison of the efficiency of several enzyme mixtures on a specific material; time course for saccharification; etc.
A standard saccharification protocol to compare the saccharification potential in different plant materials involves an eight hour hydrolysis (Figures 3 and 4). Most of the plant materials analysed requires four replicates. Under these conditions, the platform can process 80 samples/day. This analysis is being used to screen large populations of barley, maize, and brachypodium in order to establish variability in saccharification potential and the genes involved in its determination4.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich bei A Viksø-Nielsen (Novozymes) für die Gabe des cellulolytischer Enzyme danken. Diese Arbeit wurde von FP7 VERLÄNGERUNG und BBSRC Projekte BB/G016178 und BB/G016194 finanziert.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
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Grinding & weighing robot | Labman Automation | |
2 ml micro tube with caps | Sarstedt Ltd | 72.694 |
5 mm stainless steel beads | Qiagen Ltd | 69989 |
1.2ml Abgene square well storage plates | Fisher Scientific Ltd | TUL-050-050C |
Whatman cap mat for 96 square well plates | Fisher Scientific Ltd | 7704-0104 |
Liquid hanling robot | Tecan Group Ltd. | Freedom Evo 200 |
Sulphuric acid | Fisher Scientific Ltd | S/9231/PB17 |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific Ltd | BPE359-500 |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750-500G |
Acetic acid | Fisher Scientific Ltd | A/0420/PB17 |
Novozyme 188 | Novozyme | DCN00214 |
Celluclast 1.5L | Novozyme | CCN03122 |
96 well PCR full skirt plates | Sarstedt Ltd | 72.1980.202 |
D-Glucose | Fisher Scientific Ltd | G/0450/53 |
3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | 129739-25G |
DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9163-1G |
Corning microplate 96 well flat bottom | Fisher Scientific Ltd | TKT-521-050H |
Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate | Sigma-Aldrich | F1668-250G |
Sulfamic acid | Sigma-Aldrich | 242772-500G |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific Ltd | 12462-0026 |