本协议描述了如何量化的镁(二)依赖RNA的三级结构的形成由两个羟基自由基足迹方法。
RNA分子在生物学中发挥的重要作用。除了传递遗传信息,RNA折叠成独特的三级结构,实现特定的生物学作用,作为调节剂,粘结剂或催化剂。有关大专院校的联系形成的信息是必须了解的RNA分子的功能。羟基自由基(•OH)是独特的结构由于其反应活性高,体积小的核酸探针。,作为一个足迹探头使用时,羟基自由基地图的溶剂可及表面的DNA和RNA的磷酸骨干如单核苷酸分辨率罚款。羟基自由基足可以用来识别内分子间的接触面,例如在DNA -蛋白质和RNA -蛋白质复合物的核苷酸。 3平衡和动力学4转换可以由羟基自由基足迹作为一个soluti功能进行变量或时间,分别。的足迹的一个主要特点是有限的接触探头(例如,“单次击中动力学”)中的每个核苷酸的聚合物均匀采样的结果。5
在这个视频文章中,我们使用的四膜虫核酶的小四至小六的域名,说明RNA样品制备和一个镁(II)介导的折叠等温线的决心。我们描述了使用众所周知的羟基自由基足迹协议,要求H 2 O 2(我们称之为“过氧化”协议)和一个有价值的,但并不广为人知,替代使用自然溶解O 2的(我们称之为“氧化“协议)。提交的数据压缩,转换和分析程序概述。
羟基自由基足迹是一个有价值的工具,以评估核酸的溶剂可及表面面积。定性和定量的形成三级结构14,可以遵循作为一个功能参数,如离子种类和浓度,pH值,温度,结合蛋白或折叠的共同因素。引人注目的一条直线前进和廉价的协议,以及由此产生的溶剂可及单核苷酸水平上的折叠信息的结合,使得这种方法非常有吸引力的。传统的•OH足迹反应是增加H 2 O 2,我们称为“过氧?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作是支持的国家卫生RO1 – GM085130研究所和国家科学基金会MCB0929394的资助。我们感谢她的盛情款待,让我们在她的实验室电影马里昂施密特博士。
Name | Company | Cat# |
---|---|---|
Sodium Cacodylate (Caution! Toxic) | Sigma | C4945-25g |
EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G |
DEPC treated water | Ambion | AM9915G |
Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 |
MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G |
Urea | Ambion | AM9902 |
Sodium Citrate | Sigma | W302600 |
tRNA | Sigma | R-7876 |
Sodium-L-ascorbate | Sigma | A7631-25g |
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma | F1543-500g |
RNase T1 | Fermentas | EN0541 |
Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | 349887 |