मॉनिटरिंग शाही सेना संरचना में 'Peroxidative' और 'ऑक्सीडेटिव' हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprinting द्वारा संतुलन परिवर्तन
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मात्रा ठहराना करने के लिए (द्वितीय) मिलीग्राम निर्भर हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprinting की दो विधियों द्वारा शाही सेना तृतीयक संरचना के गठन.
Abstract
शाही सेना अणु जीव विज्ञान में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं. आनुवांशिक जानकारी संचारण के अलावा, शाही सेना अद्वितीय तृतीयक नियामक, बांधने की मशीन, या उत्प्रेरक के रूप में एक विशिष्ट भूमिका जीवविज्ञान पूरा संरचनाओं में गुना कर सकते हैं. तृतीयक संपर्क गठन के बारे में सूचना शाही सेना अणु के समारोह को समझने के लिए आवश्यक है. हाइड्रॉक्सिल कण (OH •) में अपने उच्च जेट और छोटे आकार के कारण न्यूक्लिक एसिड की संरचना का अनूठा जांच कर रहे हैं 1. जब एक footprinting जांच के रूप में इस्तेमाल किया, हाइड्रॉक्सिल कण के साथ 1 डीएनए और आरएनए 2 के phosphodiester रीढ़ की विलायक सुलभ सतह नक्शा के रूप में एकल nucleotide संकल्प के रूप में ठीक है. हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprinting के लिए एक intermolecular संपर्क सतह के भीतर है, जैसे 1 डीएनए प्रोटीन और आरएनए प्रोटीन परिसरों में nucleotides की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 3 संतुलन और संक्रमण 4 गतिज soluti के एक समारोह के रूप में हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprinting आयोजन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है हैपर चर या समय क्रमशः. Footprinting की एक प्रमुख विशेषता है कि जांच करने के लिए सीमित जोखिम (जैसे, 'एकल मारा कैनेटीक्स) बहुलक के प्रत्येक nucleotide की वर्दी नमूना में परिणाम है 5 .
इस वीडियो लेख में, हम P4-P6 Tetrahymena ribozyme के डोमेन का उपयोग करने के लिए शाही सेना नमूना तैयार करने और मिलीग्राम (द्वितीय) मध्यस्थता तह isotherms का निर्धारण वर्णन. हम अच्छी तरह से जाना जाता हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprinting प्रोटोकॉल है कि एच 2 2 हे (हम peroxidative 'प्रोटोकॉल कहते) और एक मूल्यवान है, लेकिन व्यापक रूप से नहीं जाना जाता विकल्प है, कि का उपयोग करता है स्वाभाविक रूप से भंग 2 हे है ( हम फोन की आवश्यकता का उपयोग का वर्णन इस ' 'oxidative प्रोटोकॉल). डेटा कमी, परिवर्तन और विश्लेषण की प्रक्रिया के एक सिंहावलोकन प्रस्तुत किया है.
Protocol
Discussion
हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी footprinting nucleic एसिड की सॉल्वैंट सुलभ सतह क्षेत्र का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है. तृतीयक 14 संरचना के गुणात्मक और मात्रात्मक गठन आयन प्रकार और एकाग्रता, पीएच, तापमान, बंधनक…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्वास्थ्य RO1 – GM085130 के राष्ट्रीय संस्थान और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन MCB0929394 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. हम उसे आतिथ्य के लिए और फिल्म के लिए हमें उसे प्रयोगशाला में अनुमति देने के लिए डॉ. मैरियन श्मिट धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Cat# |
|---|---|---|
| Sodium Cacodylate (Caution! Toxic) | Sigma | C4945-25g |
| EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G |
| DEPC treated water | Ambion | AM9915G |
| Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 |
| MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G |
| Urea | Ambion | AM9902 |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 |
| tRNA | Sigma | R-7876 |
| Sodium-L-ascorbate | Sigma | A7631-25g |
| Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma | F1543-500g |
| RNase T1 | Fermentas | EN0541 |
| Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | 349887 |
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