Vivo दोहरी सब्सट्रेट bioluminescent इमेजिंग में

Summary

हम साथ साथ निर्माण करने के लिए, कल्पना, और दोनों जुगनू और renilla luciferase एंजाइमों की bioluminescent प्रतिक्रियाओं metastatic स्तन कैंसर की कोशिकाओं में उनके विकास और मेटास्टेसिस के दौरान व्यक्त यों विधियों का वर्णन<em> Vivo में</em>.

Abstract

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies ^1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays ⁴. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor ^4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells ^7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

Protocol

1. सीएमवी चालित Renilla luciferase स्थिर अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल और एक स्थिर clonal जनसंख्या के चयन इस renilla luciferase रिपोर्टर की अभिव्यक्ति के लिए पसंदीदा तरीका है. इस दृष्टिकोण के अतिरिक्त माध्यमिक संवाददाता constructs (जैसे, जुगनू luciferase या फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के बाद शुरूआत के बाद एक और अधिक सुसंगत और वर्दी renilla luciferase अभिव्यक्ति पैदावार. अभिव्यक्ति वेक्टर एन्कोडिंग renilla luciferase के साथ ब्याज की घातक pcDNA3.1 – hygro या किसी अन्य प्लाज्मिड शरण एक चयन मार्कर के रूप में, कोशिकाओं transfect. अभिकर्मक के बाद कई दिनों के लिए सप्ताह लिए एक अनुकूलित एंटीबायोटिक एकाग्रता के तहत transfectants व्यक्ति कालोनियों, जो बाद में व्यक्तिगत और subcultured अलग कर रहे हैं के अलगाव की सुविधा के लिए जगह है. ≥ 10 व्यक्ति renilla luciferase व्यक्त कालोनियों का चयन renilla अभिव्यक्ति की सीमा पर नजर रखने के लिए. <li> Renilla luciferase की उच्च मात्रा को व्यक्त कालोनियों बाद कार्यात्मक के अधीन हैं करने के लिए सुनिश्चित करें कि उनके पैतृक समकक्षों के (i) pathophysiological गुणों को बनाए रखा जाता है का विश्लेषण करती है, और (ii) renilla अभिव्यक्ति मूल्यों विचलित या नहीं समय के साथ बदल नहीं है. ये कदम बिल्कुल अलग और अध्ययन clonal वेरिएंट / deviants से बचने के लिए, और जीनोम में renilla निर्माण के उचित एकीकरण को मान्य करने के लिए आवश्यक हैं. एक बार एक स्थिर transfectant अलग है और सत्यापित, एक चयनात्मक दबाव को दूर करने और आश्वासन दिया है कि renilla luciferase की अभिव्यक्ति दोनों इन विट्रो में और vivo में समय की विस्तारित लंबाई से अधिक स्थिर रहेगा. 2. अभिव्यक्ति, चयन, और प्रोमोटर चालित inducible जुगनू luciferase कार्यात्मक सत्यापन एक pGL4 luciferase प्लाज्मिड रिपोर्टर एक चयन मार्कर शरण में ब्याज के प्रमोटर Subclone (जैसे, पुर) omycin कि स्थिर renilla अभिव्यक्ति (जैसे, hygromycin) के लिए चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि से अलग है. मैं कदम के रूप में घातक कोशिकाओं transfect, और बाद में जुगनू luciferase व्यक्त कोशिकाओं की एक स्थिर पॉलीक्लोनल आबादी के लिए चुनें. क्योंकि स्थान है जहाँ एक रिपोर्ट जीन जीनोम में एकीकृत अपनी अभिव्यक्ति और विनियमन पर गलत प्रभाव बटोर कर सकते हैं, यह दृढ़ता से जुगनू luciferase व्यक्त कोशिकाओं के पॉलीक्लोनल आबादी के लिए चयन clonal आबादी के रूप में करने का विरोध किया कि (i) रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है अधिक सही है कि माता – पिता की कोशिकाओं में अंतर्जात जीन की दर्शाता है, और (ii) जीन अभिव्यक्ति पर एकीकरण प्रभाव औसत और विषम सेल आबादी में कम कर रहे हैं. घातक कोशिकाओं stably दोनों renilla और जुगनू luciferases व्यक्त करने के लिए इंजीनियर सामूहिक दोहरी bioluminescent संवाददाता कोशिकाओं, या DBR कोशिकाओं के रूप में भेजा जाता है. पारंपरिक <em> इन विट्रो सेल आधारित luciferase रिपोर्टर जीन assays में, सत्यापित करें कि DBR कोशिकाओं जुगनू luciferase अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए, या तो सकारात्मक या नकारात्मक, एक है कि माता पिता का ये वैक्टर के साथ transiently ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में मनाया के साथ सहमत तरीके में. इसी तरह, सत्यापित करें कि सीएमवी संचालित renilla की अभिव्यक्ति विभिन्न सेल stimulations या उपचार की स्थिति द्वारा विनियमित नहीं है. ऐसा करने के लिए, 24 अच्छी तरह प्लेटें में संस्कृति DBR और माता – पिता की कोशिकाओं, और सीएमवी renilla मूल और प्रमोटर – जुगनू के साथ बाद में सह transfect transiently माता पिता कोशिकाओं DBR कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया constructs. उसके बाद, DBR और ब्याज के प्रमोटर को विनियमित करने के लिए, और बाद में जुगनू और renilla PROMEGA दोहरी luciferase परख किट का उपयोग luminescence quantitate ज्ञात कारकों या औषधीय एजेंटों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट पैतृक कोशिकाओं का इलाज. 3. 4T1 प्राथमिक स्तन ट्यूमर की स्थापना Metastatic 4T1 स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं कि हमकमी बाह्यास्तर अथवा किसी अंग की बनावट के बाहरी आवरण संबंधित कृंतक रोगज़नक़ों पाया फिर stably एक सीएमवी संचालित renilla (pcDNA3.1 सीएमवी renilla luciferase hygro) luciferase और एक SBE संचालित जुगनू luciferase (pGL4.2 – SBE जुगनू luciferase Puro) के व्यक्त इंजीनियर थे ऊपर वर्णित है. मुख्य रूप से फेफड़ों में सहज metastases के गठन में इन स्तन कैंसर कोशिकाओं के परिणामों के orthotopic engraftment. 4T1 कोशिकाओं पारंपरिक 2-dimensional टिशू कल्चर प्रणाली में अपने प्रचार के दौरान संगम तक पहुँचने की अनुमति नहीं चाहिए, और वे उनके vivo टीका में पहले दिन passaged किया जाना चाहिए. 4T1 कोशिकाओं trypsinization से अलग हो सकता है विकास मीडिया में अच्छी तरह से धो, और चाहिए पीबीएस में 2×10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता को पतला और तुरंत बर्फ पर संग्रहीत. महिला / Balb सी चूहों (4-6 सप्ताह पुराने) 3% की एक प्रेरण isoflurane और 1% isoflurane की एक खुराक पर संज्ञाहरण के तहत बनाए रखा खुराक के साथ anesthetized होना चाहिए. साथ swabbing द्वारा इंजेक्शन साइट तैयार70% isopropyl शराब. एक संदंश का प्रयोग, धीरे समझ और 4 वंक्षण स्तन पैड उठा. ध्यान से, एक 27.5 गेज सुई बेवल ओर जगह और निपल के तहत सीधे स्तन वसा पैड में सुई, विशेष ख्याल रख रही उदर गुहा में सुई नहीं धक्का. ग्रंथि रिलीज और धीरे धीरे स्तन वसा पैड में सेल निलंबन (1×10 4 कोशिकाओं) का 50 μl इंजेक्षन. 4. प्रारंभिक दोहरी Luminescent इमेजिंग स्तन वसा पैड पर 4T1 कोशिकाओं engrafting के तुरंत बाद और जबकि चूहों अभी भी कर रहे हैं anesthetized, पार्श्व पूंछ नस में Rediject Coelenterazine के 100 μl इंजेक्षन. यह इष्टतम सब्सट्रेट विक्रेता और जानवरों द्वारा सहन द्वारा सिफारिश की एकाग्रता है. तुरंत isoflurane नाक शंकु में IVIS 200 इमेजिंग प्रणाली के भीतर माउस और जगह एक 0.5-1 मिनट luminescent छवि प्राप्त. इंजेक्शन और छवि अधिग्रहण के बीच क्षमता बहुत महत्वपूर्ण संकेत के रूप में है,luciferase लिए renilla precipitously बूँदें ~ 30 सेकंड के बाद इंजेक्शन. माउस वापस अपने पिंजरे में और जगह यह ≥ 1 घंटा है, जो यह सुनिश्चित करता है कि किसी भी अवशिष्ट renilla luciferase संकेत और छितराया हुआ है कि माउस को पूरी तरह संज्ञाहरण से बरामद किया है के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं. आईपी ​​इंजेक्शन के माध्यम से 150 मिलीग्राम / किलो डी Luciferin पोटेशियम नमक के प्रशासन और 5 मिनट इंतज़ार. यह डी Luciferin, जो परीक्षण पशुओं में इंजेक्शन के बाद 5-15 मिनट के लिए एक स्थिर luminescent संकेत प्रदान करता है इष्टतम एकाग्रता है. ने isoflourane का उपयोग कर माउस anesthetize और IVIS-200 में जगह, देखभाल करने के लिए एक बहुत ही मूल renilla अधिग्रहण करने के लिए रिश्तेदार की स्थिति में पशु की स्थिति. जुगनू के इस संकेत के समग्र तीव्रता ब्याज की प्रमोटर की गतिविधि पर निर्भर करती है, और इस तरह के रूप में, visualizing जुगनू luciferase गतिविधि विस्तारित अधिग्रहण समय की आवश्यकता हो सकती है. IVIS जीवित प्रतिमा "फोटॉनों" मोड में सेट सॉफ्टवेयर का उपयोग, valu की स्थापनातों दोनों renilla और आधारभूत रिश्तेदार luminescence अनुपात (RLR) स्थापित करने के लिए एक साधन के रूप में जुगनू अधिग्रहण के लिए. 5. अनुदैर्ध्य Luminescent इमेजिंग 4T1 कोशिकाओं को अत्यधिक आक्रामक हैं, 1×10 4 कोशिकाओं की कि इस तरह के टीका आम तौर पर एक सप्ताह के भीतर स्पर्शनीय ट्यूमर गठन के लिए होता है, और 4-5 हफ्तों के भीतर पशु की मारक. 4T1 ट्यूमर 4 सप्ताह में एक अंतर्निहित प्रवृत्ति नासूरवाला हो जाना है. और ulcerated ट्यूमर के विकास के रखरखाव के अलग IACUC अनुमोदन की आवश्यकता हो सकती है. 4T1 ट्यूमर यहाँ दिखाया अध्ययन केस वेस्टर्न रिजर्व विश्वविद्यालय में IACUC द्वारा अनुमोदित किया गया है. जैसा कि ऊपर वर्णित है, चूहों Rediject Coelenterazine साथ साप्ताहिक इंजेक्शन चाहिए सामान्य ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस की निगरानी, ​​के रूप में के रूप में D-Luciferin के साथ अच्छी तरह से ट्यूमर के विकास के विभिन्न चरणों के दौरान मार्ग विशेष के संकेत की निगरानी. हर बार की देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें कि renilla luciferase संकेत पूरी तरह से अधिग्रहण करने के लिए पहले छितराया हुआ लोजुगनू luciferase संकेत. 4T1 ट्यूमर के रूप में विकास और प्रगति, renilla luciferase अधिग्रहण प्रारंभिक renilla मानक के अनुसार और प्राथमिक ट्यूमर के विकास पर नज़र रखने के लिए एक साधन के रूप में ट्यूमर सेल टीका के समय में मापा मूल्यों के लिए सामान्यीकृत किया जाना चाहिए. इससे भी महत्वपूर्ण बात है, समय के साथ RLR मूल्यों की गणना व्यक्ति संकेत ट्यूमर के विकास और प्रगति के सापेक्ष सिस्टम के अस्थायी विनियमन स्थापित करेगा. प्रकट फेफड़े मेटास्टेसिस 3-4 सप्ताह के भीतर स्तन वसा पैड पर 4T1 सेल engraftment के बाद स्पष्ट हो जाता है. प्राथमिक ट्यूमर के लिए गणना उन बनाम फेफड़े RLR मूल्यों की तुलना व्यक्ति संकेत ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस के सापेक्ष प्रणालियों के स्थानिक विनियमन स्थापित करता है. 6. दो एक एकल पशु में अद्वितीय सेल प्रकार की दोहरी bioluminescent इमेजिंग इंजीनियर एक स्तन कैंसर कोशिका stably अभिव्यक्ति renilla सीएमवी संचालित luciferase ऊपर वर्णित के रूप में करने के लिए लाइन. इस दोहराएँइंजीनियरिंग प्रक्रिया का उपयोग कर एक दूसरे अलग स्तन कैंसर कोशिका लाइन पर सीएमवी चालित जुगनू luciferase. हम साथ साथ मिश्रित renilla luciferase व्यक्त उनके nonmetastatic और isogenic जुगनू luciferase व्यक्त 4T07 10 समकक्षों, 11 के साथ 4T1 कोशिकाओं. इन मिश्रित स्तन कैंसर सेल आबादी के अनुपात परिवर्तनीय बाद स्तन वसा पैड के रूप में ऊपर वर्णित में इंजेक्ट कर रहे हैं. तुरंत दोनों जुगनू और renilla luciferase छवियों को प्राप्त करने के लिए एक दिया inoculated सेल मिश्रण के प्रारंभिक RLRs प्रतिनिधि स्थापित. अनुदैर्ध्य दोहरी bioluminescent इमेजिंग कल्पना और प्राथमिक ट्यूमर के भीतर सेलुलर संरचना में परिवर्तन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक स्तन कैंसर के ट्यूमर के विकास और प्रगति के सापेक्ष व्युत्पन्न spatiotemporal मेटास्टेसिस ट्रैक करेगा. वैकल्पिक रूप से, व्यक्तिगत स्तन कैंसर सेल आबादी माउस में अलग – अलग स्थानों में inoculated किया जा सकता है (यानी सही और बाएँ पेट स्तन वसा पैड)प्रणालीगत प्रभावों का आकलन करने के लिए इन दो आबादी ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस के विभिन्न चरणों के दौरान एक दूसरे पर दिखा रहे हैं. 7. प्रतिनिधि परिणाम: दोहरी bioluminescent इमेजिंग के एक प्रमुख तथ्य यह है कि प्रत्येक छवि आंतरिक रूप से संगत और नियंत्रित है, कि इस तरह के जारी एक महत्वपूर्ण मीट्रिक के रूप में प्राथमिक ट्यूमर समारोह से प्राप्त संकेतों के समग्र प्रत्येक renilla और जुगनू अधिग्रहण की सफलता या विफलता का आकलन करने की ताकत में निहित है. इमेजिंग प्रक्रिया के इस पहलू की गतिविधि renilla luciferase, जिसका सब्सट्रेट Coelenterazine ऑक्सीकरण के लिए अत्यधिक संवेदनशील है के अधिग्रहण के दौरान विशेष रूप से महत्वपूर्ण है कि ऑटो luminescence करने की क्षमता में परिणाम है. चित्रा 1A इस तरफ प्रभाव है, जो तुरंत nonspecific luminescent आंतों, स्थापित प्राथमिक ट्यूमर नहीं पथ से प्राप्त संकेतों के रूप में प्रकट होता है की एक उदाहरण दिखाता है. आमतौर पर, इन nonspecific Coelenterazine transpir का संकेतई निम्नलिखित इस renilla luciferase सब्सट्रेट की नसों में इंजेक्शन में विफल रहा है. हालांकि, एक बार मजबूत प्राथमिक ट्यूमर व्युत्पन्न renilla संकेत प्राप्त किया गया है (चित्रा 1B, छवि बाएं), यह मार्ग विशेष के संकेत इमेजिंग जुगनू luciferase (चित्रा 1B, सही पैनल), D-Luciferin जिसका से व्युत्पन्न माप पर कब्जा करने में आगे बढ़ने के लिए सुरक्षित है सब्सट्रेट अत्यधिक आईपी इंजेक्शन पर स्थिर है और ऑटो luminescence पृष्ठभूमि की नगण्य स्तर का उत्पादन. 1 चित्रा renilla और जुगनू व्युत्पन्न bioluminescent छवियों vivo RLRs में गणना. (ए) एक असफल आंत्र पथ से nonspecific संकेत में जिसके परिणामस्वरूप Coelenterazine के चतुर्थ इंजेक्शन का एक उदाहरण हासिल. सर्किल और पीटी प्राथमिक ट्यूमर के अनुमानित स्थान से संकेत मिलता है (बी) एक माउस के एक सफल renilla अधिग्रहण एक 4T1 प्राथमिक ट्यूमर और पी असर.ulmonary metastases (बाएं पैनल, वसा पैड engraftment के बाद 4wk). इसी जुगनू अधिग्रहण दोनों प्राथमिक ट्यूमर और उसके फेफड़े metastases से RLRs की गणना के लिए (सी) प्राथमिक ट्यूमर के ग्राफ़िकल प्रतिनिधित्व है और फेफड़े मेटास्टेसिस RLRs पैनल बी में दिखाया चूहों (n = 4) से गणना की अनुमति देता है.

Discussion

bioluminescent इमेजिंग तकनीक का पूर्ण शक्ति अपने ट्यूमर और जटिल अनुदैर्ध्य अध्ययन है, जो यहाँ आक्रामक 4T1 स्तन कैंसर कोशिकाओं के उपयोग शामिल में वृद्धि मेटास्टेसिस यों की क्षमता में निहित है. क्योंकि इन प्रक्रियाओं दोनों luciferase संवाददाता constructs के स्थिर एकीकरण पर भरोसा करते हैं, इन तकनीकों आसानी से हो सकता है और अनुकूलित कर सकते हैं ट्यूमर latencies और metastatic क्षमताओं बदलती के अन्य कैंसर कोशिका लाइनों के लिए अनुवाद. इसमें दिखाया परिणाम के लिए भी इसी तरह, धीरे धीरे प्राथमिक ट्यूमर के विकास और उनके अंतिम metastases भीतर विशिष्ट RLRs की गणना वास्तविक समय विशिष्ट संकेत घटनाओं है कि ट्यूमर के metastatic विलंबता की उनकी अवधि के बावजूद प्रगति के दौरान भाप spatiotemporal पहचान के लिए अनुमति देता है. विशिष्ट प्रमोटर विनियामक घटनाओं की पहचान होने पर, यह दोनों प्राथमिक ट्यूमर और मानक immunohistochemical के प्रदर्शन के लिए अपनी metastatic घावों और वैशिष्ट्य आबकारी के लिए महत्वपूर्ण हैएल जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण अंतर्जात जीन और / या प्रोटीन के समान विनियमन को सत्यापित करने के लिए.

तकनीकी तौर पर बोल, दोहरी bioluminescent विश्लेषण के प्राथमिक चुनौती renilla luciferase संकेतों की अपेक्षाकृत कम अवधि में निहित है. जैसे, इस इमेजिंग तकनीक पूंछ नस इंजेक्शन प्रक्रिया के महत्वपूर्ण अनुकूलन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत रूप से इंजेक्शन पशुओं के तत्काल इमेजिंग, एक प्रक्रिया है कि समय लेने और इमेजिंग जुगनू luciferase कुछ अक्षम रिश्तेदार है की आवश्यकता है. हाल ही में, PROMEGA "Viviren," जो एक दूसरी पीढ़ी luciferase सब्सट्रेट जिसका ऑक्सीकरण की साइटों तक esterification द्वारा अवरुद्ध कोशिकाओं, जो बिंदु पर अणु तेजी de-esterified है में इस अणु लाभ प्रविष्टि का प्रतिनिधित्व करता है. सामूहिक रूप से, इस उपन्यास सब्सट्रेट प्रभावी रूप से ऑटो luminescence और nonspecific संशोधन और / या गिरावट ¹² renilla प्रेरित ऑटो luminescence मिलकर कम करती है. ऐसा करने में, इस नए renillएक luciferase सब्सट्रेट उज्जवल luminescent संकेतों पैदा, लेकिन, अत्यधिक और के "Viviren" अधिग्रहण के उपयोग के साथ जुड़े लागत अपेक्षाकृत कुछ दोहरी bioluminescent विश्लेषण में इस सब्सट्रेट के समग्र उपयोगिता का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक अध्ययन प्रदान की है. अंत में, किसी भी bioluminescent परख की संवेदनशीलता गंभीर व्यक्ति प्रकाश इकाइयों को प्राप्त करने में सीसीडी operant कैमरा पर निर्भर है. दरअसल, जैसा कि इन प्रौद्योगिकियों में सुधार करने के लिए, हम भविष्य में एक बिंदु है जहां हमारे जटिल प्रकाश मध्यस्थता bioluminescent प्रतिक्रियाओं कल्पना करने की क्षमता कुशलता से मुक्त चलती ¹³ जानवरों में भाप बनकर उड़ हो सकता है की उम्मीद है.

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue number
pGL4.2-Puro [luc2/Puro] Vector	Promega	E6751
Glomax Mult-idection system	Promega
IVIS 200 series	Caliper Life Sciences
Dual luciferase reporter Assay system	Promega	E1960
Rediject coelenterazine-h	Caliper Life Sciences	760506
D-Luciferin K-Salt	Caliper Life Sciences	122796