Häri beskriver vi de metoder för att konstruera, visualisera och kvantifiera de självlysande reaktioner både Firefly och Renilla-luciferas enzymer uttrycks i metastatiska bröstcancerceller under sin tillväxt och metastasering<em> In vivo</em>.
Vår förståelse av hur och när bröstcancer celler transit från etablerade primära tumörer på metastaser har ökat i en exceptionell hastighet sedan tillkomsten av in vivo bioluminescent imaging-teknik 1-3. Faktum möjligheten att lokalisera och kvantifiera tumörtillväxt longitudinellt i en enda kohort av djur till slutförandet av studien i motsats till att offra enskilda grupper av djur vid analysinstruktioner tider har revolutionerat hur forskare undersöker metastaser bröstcancer. Tyvärr, nuvarande metoder utesluter realtid bedömning av kritiska förändringar som genomsyra i cellsignalering system som bröstcancerceller (i) utvecklas inom primära tumörer, (ii) sprida i hela kroppen, och (iii) återinitiera proliferativa program på platser för en metastatisk lesion. Den senaste tidens framsteg inom självlysande bildbehandling gör det nu möjligt att samtidigt kvantifiera specifika spatiotemporal förändringar i genuttryck som en funktion av tumörutveckling och metastatisk progression via användning av dubbla reaktioner substrat luminiscens. För att göra detta, forskarna utnyttja för två ljus-producerande luciferas enzymer isolerade från eldfluga (Photinus pyralis) och havet pensé (Renilla reniformis), vilka båda reagerar på ömsesidigt uteslutande substrat som tidigare underlättat deras utbredda användning i in vitro-cell -baserade rapportgenprodukter analyser 4. Här visar vi in vivo användbarheten av dessa två enzymer så att en luminiscensreaktion specifikt markerar storleken och placeringen av en utvecklande tumör, medan den andra luminescerande reaktionen fungerar som ett medel för att visualisera aktiveringsstatus av specifika signalsystem under distinkta stadier av tumör och metastas utveckling. Således är syftet med denna studie är två gånger. Först kommer vi att beskriva de åtgärder som är nödvändiga för att bygga dubbla självlysande linje reporter cells, liksom de som behövs för att underlätta deras användning vid visualisera spatiotemporal reglering av genexpression under vissa steg av metastatiska kaskaden. Använda 4T1 modellen av bröstcancer metastaser, visar vi att in vivo aktiviteten av en syntetisk Smad bindningselement (SBE) promotorn minskade dramatiskt i pulmonell metastas jämfört med den som uppmätts i den primära tumören 4-6. Nyligen, har bröstcancer metastas visat att regleras av förändringar i den primära tumören mikromiljön och reaktiv stroma, inklusive de som förekommer i fibroblaster och infiltrerande immunceller 7-9. Således kommer vår andra mål vara att påvisa nyttan av dubbla självlysande tekniker i övervakningen av tillväxt och lokalisering av två unika cellpopulationer hyste i ett enda djur under bröstcancer tillväxt och metastasering.
Den absoluta makt självlysande avbildningstekniker ligger i deras förmåga att kvantifiera tumörtillväxt och metastasering i komplexa longitudinella studier, som här är involverade användningen av aggressiva 4T1 bröstcancerceller. Eftersom dessa förfaranden förlitar sig på den stabila integrationen av både luciferas reporterkonstruktioner, kan dessa tekniker kan lätt anpassas och översättas till andra cancercellinjer av varierande tumör latenser och metastatiska kapacitet. I likhet med de resultat som visas här, beräkna specifika RLRs inom långsamt utveckla primära tumörer och deras eventuella metastaser möjliggör realtid Spatiotemporal identifiering av specifika signalering händelser som genomsyra under metastaserande progression av tumörer oavsett längd latens. Vid identifiering av specifika promotor regulatoriska händelser är det viktigt att skära både den primära tumören och dess metastaser för utförandet av standard immunhistokemiska och differentieringl genuttryck analyser för att verifiera liknande reglering av den endogena genen och / eller protein.
Tekniskt sett den primära utmaningen dubbla självlysande analyser ligger på relativt kort varaktighet Renilla-luciferas signalerna. Som sådan kräver denna avbildningsteknik signifikant optimering av svansveninjektion förfarande, liksom omedelbar avbildning av individuellt injicerade djur, en process som är tidsödande och något ineffektivt i förhållande till avbildning eldflugeluciferas. Nyligen introducerade Promega "Viviren," som representerar ett andra substrat generationens luciferas vars ställen för oxidation blockeras genom förestring tills denna molekyl vinster inträde i celler, vid vilken punkt molekylen är snabbt avestrad. Sammantaget sänker denna roman substrat effektivt automatisk luminiscens och ospecifik modifiering och / eller nedbrytning kopplat till Renilla-inducerad auto-luminiscens 12. Härvid denna nya renillen luciferassubstrat ger klarare självlysande signaler, men har de höga kostnader i samband med förvärvet och användningen av "Viviren" som relativt få studier som krävs för att utvärdera den samlade nyttan av detta substrat i dubbla självlysande analyser. Slutligen, är känsligheten av varje bioluminescensanalys kritiskt beroende på CCD-kameran operanta förvärva enskilda ljusenheter. Verkligen, som denna teknik förbättras ser vi en punkt i framtiden där vår förmåga att visualisera komplexa ljus-medierade självlysande reaktioner kan genomsyra effektivt i fria rörliga djur 13.
The authors have nothing to disclose.
WPS stöddes delvis av anslag från National Institutes of Health (CA129359), Susan G. Komen för Cure stiftelsen (BCTR0706967), Department of Defense (BC084561) och Seidman Cancer Center, medan MKW stöddes av en stipendium från American Cancer Society (PF-09-120-01). Ytterligare stöd för detta arbete lämnades av Case Center för Imaging Research, Case Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703) och cystisk fibros Center (P30 DK027651).
Name of reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
pGL4.2-Puro [luc2/Puro] Vector | Promega | E6751 |
Glomax Mult-idection system | Promega | |
IVIS 200 series | Caliper Life Sciences | |
Dual luciferase reporter Assay system | Promega | E1960 |
Rediject coelenterazine-h | Caliper Life Sciences | 760506 |
D-Luciferin K-Salt | Caliper Life Sciences | 122796 |