DT40, en modell ryggradsdjur genetiska system, ger ett kraftfullt verktyg för att analysera proteiners funktion. Här beskriver vi en enkel metod som möjliggör kvalitativ analys av parametrar som påverkar DNA-syntesen under S-fas i DT40 celler vid enda molekyl nivå.
Underhåll av replikationsgaffeln stabilitet är av yttersta vikt för delande celler för att bevara lönsamheten och förebygga sjukdom. De processer som inte bara se till trogna genomet dubbelarbete i ansiktet av endogena och exogena DNA-skador men också förebygga genomisk instabilitet, en erkänd orsakande faktor i tumörutveckling.
Här beskriver vi en enkel och kostnadseffektiv fluorescensmikroskopi-baserad metod för att visualisera DNA-replikation i aviär B-cellinje DT40. Denna cellinje ger ett kraftfullt verktyg för att undersöka proteiners funktion in vivo genom omvänd genetik i ryggradsdjur celler 1. DNA-fiber RADIOFOTOGRAFERING i DT40 celler som saknar en specifik gen gör att man kan belysa funktionen av denna gen produkt i DNA-replikation och arvsmassa stabilitet. Traditionella metoder för att analysera dynamiken replikationsgaffeln i ryggradsdjur celler är beroende av att mäta den totala frekvensen av DNA-syntesen i en population av puls-märkta celler. Detta är en kvantitativ metod och inte tillåter kvalitativ analys av parametrar som påverkar DNA-syntesen. Däremot kan graden av rörligheten för aktiva gafflar följas direkt när man använder tekniken DNA-fiber 2-4. I denna metod är begynnande DNA-märkt in vivo genom inkorporering av halogenerade nukleotider (Fig. 1A). Därefter är individuella fibrer sträcks ut på ett objektglas, och den märkta DNA-replikation skrifter färgas med specifika antikroppar och visualiseras genom fluorescensmikroskopi (Fig. 1B). Inledande av replikering samt gaffel riktning bestäms av efterföljande användning av två olika modifierad analoger. Dessutom tillåter dubbla märkning metod för kvantitativ analys av parametrar som påverkar DNA-syntesen under S-fasen, dvs replikering strukturer såsom pågående och stannade gafflar, replikering ursprung densitet samt avslutningar gaffel. Slutligen kan experimentell förfarandet åstadkommaED inom en dag, och kräver endast allmän laboratorieutrustning och en fluorescensmikroskop.
Vi beskriver en metod som möjliggör kvantitativ analys av parametrar som påverkar DNA-syntesen under S-fas vid en enda molekyl nivå. Under de senaste tio åren har olika versioner av DNA-fiber RADIOFOTOGRAFERING teknik som utvecklats för att visualisera flödet av enskilda replikering gafflar i levande celler. Den kritiska parametern i alla dessa tekniker är det förfarande som används för att uppnå bästa möjliga sträckningen av DNA på glasytor ger väl separerade DNA fibrer. Ett viktigt steg för att uppnå detta är inkubationstiden av cellsuspensionen på objektglas samt lys tid. Dessa parametrar är beroende av temperatur och luftflöde i en viss labb och bör bestämmas empiriskt. Den praktiska delen av en DNA-fiber experiment vanligen genomförda inom ett dygn. Det är dock följande bild insamling och analys mer tidskrävande och kräver övning.
Märkningen protokollet kan justerasApted att svara på olika vetenskapliga problem: att använda en agent som stör replikering under den andra pulsen märkning monitorer gaffel töjning / stopp som svar på replikationsförmåga stress. I detta scenario inte den första etiketten inte behöver tvättas ut som den andra nukleotid läggs i överskott. Alternativt kan läkemedel som hämmar replikationen användas i kombination eller strax efter tillägg av den första etiketten. Detta kräver den första etiketten och läkemedlet tas bort innan den andra nukleotid-analog tillämpas. Detta förfarande gör att man kan avgöra betydelsen av olika faktorer DNA-reparation på replikationsförmåga gaffel stabilitet / återhämtning under förhållanden med replikationsförmåga stress (dvs. gaffel motorstopp och / eller kollaps). Anmärkningsvärt, kan en mer detaljerad analys av uppgifter om DNA-replikation programmet utföras med hjälp av ett alternativa metoder som kombinerar DNA kamning och fluorescens in situ hybridisering. Detta är dock tekniskt mer utmanande och kräver utgifteromfattande utrustning.
Förmågan att kvalitativt och kvantitativt analysera uppgifter om DNA-replikation ger ett viktigt verktyg för att undersöka defekter i DNA-replikation sig liksom de vägar som undertrycker genomisk instabilitet i samband med replikering gafflar. Utan tvekan kommer denna analys bidra till att ytterligare belysa mekanismerna för replikering-medierad DNA-reparation som gör att normala celler att reagera / anpassa sig till förändringar i miljön samt hur cancerceller använder dessa mekanismer att motstå toxicitet av läkemedel riktade replikering gafflar.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr T. Helleday och Dr E. Petermann för hjälp med fiber-tekniken samt medlemmar i lab för hjälpsamma diskussion. WN stöds av en Senior International Research Fellowship från föreningen för internationell cancerforskning och av den polska statliga kommittén för vetenskaplig forskning bevilja (N301 165.935).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA | A15-151 | |
Chicken serum | Sigma | C5405 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
5-Iodo-2′-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
5-Chloro-2′-deoxy-uridine (CldU) | Sigma | C6891 | |
Microscope slides SuperFrost | VWR | 631-0910 | |
Cover slips No1 | Scientific lab suppplies | MIC3234 | |
Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
sheep anti-mouse Cy3 | Sigma | C2181 | |
goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 | |