Bilaminar Co-kultur Primär Rat kortikala neuron och Glia
Summary
Här ger vi ett protokoll för kortikala odling råtta neuron i närvaro av en stödjeceller feeder lager. Den odlade nervceller skapa polaritet och skapa synapser och kan separeras från Glia för användning i olika applikationer, såsom elektrofysiologi, kalcium bildhantering, cell analyser överlevnad, immuncytokemiundersökning och RNA / DNA / protein isolering.
Abstract
Denna video kommer att guida dig genom processen att kortikala odling råtta neuron i närvaro av en gliaceller feeder lager, ett system som kallas en bilaminar eller co-kultur-modellen. Detta system är lämpligt för en mängd olika experimentella behov som kräver antingen ett glas eller plast tillväxt substrat och kan även användas för odling av andra typer av nervceller.
Rat kortikala neuroner från det sena embryonala stadium (E17) är pläterade på glas täckglas eller vävnad rätter kultur inför en feeder lager av Glia odlas på rätter eller plast täckglas (sk Thermanox), respektive. Valet mellan de två konfigurationer beroende på den specifika används experimentell teknik, som kan kräva, eller inte, är att nervceller som odlas på glas (t.ex. kalcium imaging kontra Western blot). Den gliaceller feeder layer, en astroglia berikade sekundära kultur blandad Glia, separat förberedd från cortex av nyfödda råttungar (P2-4) innan den neuronaladissekering.
En stor fördel med denna kultur-system jämfört med en kultur av nervceller är bara stöd av neuronala tillväxt, överlevnad och differentiering som trofiska faktorer som utsöndras från gliaceller mataren lagret, vilket bättre liknar hjärnan miljön in vivo. Dessutom kan samtidig kulturen användas för att studera neuronala-glial interaktioner 1.
Samtidigt är Glia föroreningar i neuronala lager förebyggas på olika sätt (låg täthet kulturen, tillägg av mitotiska hämmare, brist på serum och användning av optimerade odlingsmedium) leder till en nästan ren neuronal skikt, jämförbart med andra etablerade metoder 1 -3. Nervceller kan separeras från gliaceller lagret när som helst under kultur och användas för olika experimentella applikationer från elektrofysiologi 4, cell-och molekylärbiologi 5-8, biokemi 5, bildhantering och mikrofonroscopy 4,6,7,9,10. Den primära neuron förlänga axoner och dendriter för att bilda fungerande synapser 11, en process som inte observerats i neuronala cellinjer, även om vissa cellinjer sträcker processer.
En detaljerad protokollet av hippocampus odling råtta neuron med hjälp av detta samarbete kultur-systemet har beskrivits tidigare 4,12,13. Här har vi närmare ett modifierat protokoll lämpad för kortikala neuroner. Som ca 20×10 6 celler återvinns från varje råtta embryo, är denna metod särskilt användbar för experiment som kräver ett stort antal nervceller (men inte om en mycket homogen neuronal befolkningen). Beredningen av nervceller och Glia måste planeras i en tid-specifika sätt. Vi kommer att ge steg-för-steg-protokoll för kortikala odling råtta neuron samt odling gliaceller att stödja nervceller.
Protocol
Discussion
Detta protokoll ger en metod för primär odling råtta kortikala neuron i närvaro av gliaceller, samtidigt som nervceller lätt kan isoleras för experimentell analys. Den Glia stödja utvecklingen av en sund neuronala fenotypen, samtidigt modulerande neuronal svar på experimentella behandlingar i en fysiologiskt relevant sätt. Dessutom, genom passaging den primära Glia innan odling av nervceller denna cell befolkningen blir selektivt anrikas i astrocyter och därmed förhindra inflammatoriska microglial stimulerin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar tidigare laboratorium medlemmar som har bidragit till förbättring av detta protokoll och NIH för stöd under åren (DA19808 och DA15014 till OM). Anna Abt 1 är en karl av "tvärvetenskapliga och translationell forskarutbildning i neuroAIDS" (T32-MH078795), och därför var detta arbete stöds delvis av National Institutes of Health i Ruth L. Kirschstein National Research Service Award 5T32MH079785.
Materials
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| NaCl | 135 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO4 | 0.22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 310±10 mOsm |
Table 1. Dissection Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| FBS | 10% |
| Gentamicin | 50 μg/mL |
Tabe 2. Glia Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| Horse Serum | 10% |
Table 3. Neuron Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 98% |
| N2 Supplement | 1% |
| 1M HEPES | 1% |
| Ovalbumin | 50 mg/100mL |
Table 4. N2 Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Boric Acid | 50 mM |
| Sodium Borate | 12.5 mM |
Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) |
Invitrogen | 11995-073 |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated | Hyclone | 26400-044 |
| Horse Serum, Heat-inactivated | Hyclone | H1138 |
| Gentamicin (50mg/mL) | Invitrogen | 15750-060 |
| N2 Supplement (100x) | Invitrogen | 17502-048 |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 |
| Albumin from chicken egg white, Grade VI (Ovalbumin) |
Sigma-Aldrich | A2512 |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen | 15090-046 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) |
Sigma-Aldrich | D-5025 |
| Paraplast | Fisher | 12-646-106 |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma-Aldrich | C6645 |
| Stereomicroscope | Leica | Leica ZOOM 2000 |
| Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 0.13-0.17 mm |
Carolina | 633031 |
| Thermanox sheets | Grace BioLabs | HS4550 |
| Large forceps | Biomedical Recherche Instruments |
70-4000 |
| Fine-tipped No.5 forceps | Fine Science Tools |
91150-20 |
| Pattern No.1 forceps | Biomedical Recherche |
10-1400 |
| Instruments | ||
| Scissors, straight, sharp-blunt | Biomedical Recherche Instruments |
28-1435 |
| Micro Dissecting scissors | Biomedical Recherche Instruments |
11-2070 |
| Micro Dissecting Curved scissors | Biomedical Recherche Instruments |
11-1395 |
References
- Cook, A. Interactions between chemokines: regulation of fractalkine/CX3CL1 homeostasis by SDF/CXCL12 in cortical neurons. J. Biol. Chem. 285, 10563-10563 (2010).
- Nicolai, J., Burbassi, S., Rubin, J., Meucci, O. CXCL12 inhibits expression of the NMDA receptor’s NR2B subunit through a histone deacetylase-dependent pathway contributing to neuronal survival. Cell. Death. Dis. 1, e33-e33 (2010).
- Sengupta, R. Morphine increases brain levels of ferritin heavy chain leading to inhibition of CXCR4-mediated survival signaling in neurons. J. Neurosci. 29, 2534-2544 (2009).
- Meucci, O. Chemokines regulate hippocampal neuronal signaling and gp120 neurotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 14500-14500 (1998).
- Khan, M. Z. Regulation of neuronal P53 activity by CXCR 4. Mol. Cell. Neurosci. 30, 58-66 (2005).
- Patel, J. P. Modulation of neuronal CXCR4 by the micro-opioid agonist DAMGO. J. Neurovirol. 12, 492-500 (2006).
- Shimizu, S. Role of the transcription factor E2F1 in CXCR4-mediated neurotoxicity and HIV neuropathology. Neurobiol. Dis. 25, 17-26 (2007).
- Khan, M. Z. The chemokine receptor CXCR4 regulates cell-cycle proteins in neurons. J. Neurovirol. 9, 300-314 (2003).
- Khan, M. Z. The chemokine CXCL12 promotes survival of postmitotic neurons by regulating Rb protein. Cell. Death. Differ. 15, 1663-1672 (2008).
- Khan, M. Z., Vaidya, A., Meucci, O. CXCL12-mediated regulation of ANP32A/Lanp, a component of the inhibitor of histone acetyl transferase (INHAT) complex, in cortical neurons. J. Neuroimmune. Pharmacol. 6, 163-170 (2011).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8, 1454-1468 (1988).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Goslin, K., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. . Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- D’Ambrosio, J., Fatatis, A. Osteoblasts modulate Ca2+ signaling in bone-metastatic prostate and breast cancer cells. Clin. Exp. Metastasis. 26, 955-964 (2009).
