Anreicherung von NK-Zellen aus menschlichem Blut mit der RosetteSep Kit von StemCell Technologies
Summary
Natürliche Killerzellen sind eine kleine Population von Lymphozyten. Hier zeigen wir, wie diese Zellen aus menschlichem Blut durch negative Selektion zu isolieren, unter Verwendung eines Kits von StemCell Technologies. Die erhaltenen Zellen lebensfähig sind und unberührt von Antikörpern, und deshalb bereit, für eine Reihe von Prozeduren verwendet werden.
Abstract
Natürliche Killerzellen (NK)-Zellen sind große granuläre zytotoxischen Lymphozyten, die das angeborene Immunsystem gehören und eine wichtige Rolle spielen im Kampf gegen Krebs und Infektionen, sondern auch in den frühen Stadien der Schwangerschaft und die Abstoßung von Transplantaten verwickelt. Diese Zellen sind derzeit im peripheren Blut, aus dem sie isoliert werden können. Die Zellen können isoliert werden entweder positive oder negative Selektion werden. Für die positive Selektion verwenden wir Antikörper, die gegen einen Oberflächenmarker derzeit nur auf die Zellen von Interesse, während für negative Selektion verwenden wir Cocktails von Antikörpern gezielt an die Oberfläche Marker auf allen Zellen, aber die Zellen von Interesse. Diese letztere Technik zeigt den Vorteil, dass die Zellen von Interesse frei von Antikörpern, wodurch das Risiko von unerwünschten Zell-Aktivierung oder Differenzierung. In diesem Video-Protokoll zeigen wir, wie NK-Zellen aus menschlichem Blut durch negative Selektion zu trennen, mit dem RosetteSep Kit von StemCell Technologien. Das Verfahren beinhaltet den Erhalt menschlichen peripheren Blut (unter einem Institutional Review Board genehmigte Protokoll zum Schutz von Testpersonen) und Mischen mit einem Cocktail aus Antikörpern, die Markierungen fehlen auf NK-Zellen binden, sondern an allen anderen mononukleären Zellen im peripheren Blut (zB T-Lymphozyten, Monozyten …). Die Antikörper sind in der Cocktail-konjugiert sind, um Antikörper, die gegen A auf Erythrozyten Glycophorin. Alle unerwünschten Zellen und roten Blutkörperchen wird daher in Komplexen gefangen werden. Die Mischung aus Blut und Antikörper-Cocktail wird dann verdünnt, überlagert auf einem Histopaque Steigung, und zentrifugiert. NK-Zellen (> 80% rein) können an der Schnittstelle zwischen den Histopaque und die verdünnte Plasma gesammelt werden. Ähnliche Cocktails sind für die Anreicherung von anderen Zellpopulationen, wie das humane T-Lymphozyten zur Verfügung.
Protocol
Discussion
Die Zellen isoliert mit dieser Technik lassen sich weiter in verschiedenen Populationen mit anderen Zellseparation Kits getrennt werden.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Rosette Sep cocktail for human NK cells | Reagent | StemCell Technologies | 15065 | |
| PBS, steile, 1x | Reagent | Gibco / Invitrogen | 14040-058 | |
| Fetal calf serum (FCS, FBS) | Reagent | Gibco / Invitrogen | 16140-071 | |
| Histopaque-1077 | Reagent | Sigma | 10771 |
