Arricchimento di cellule NK dal sangue umano con il kit RosetteSep Technologies StemCell

Summary

Cellule killer naturali sono una piccola popolazione di linfociti. Qui mostriamo come isolare queste cellule dal sangue umano per selezione negativa, utilizzando un kit da Technologies StemCell. Le cellule ottenute sono vitali e incontaminata dagli anticorpi, e quindi pronti per essere utilizzati per una serie di procedure.

Abstract

Natural killer (NK) sono grandi linfociti granulari citotossici che appartengono al sistema immunitario innato e svolgono ruoli importanti nella lotta contro il cancro e le infezioni, ma sono anche implicati nelle prime fasi della gravidanza e rigetto del trapianto. Queste cellule sono presenti nel sangue periferico, da cui possono essere isolati. Le cellule possono essere isolate mediante selezione sia positiva che negativa. Per la selezione positiva usiamo anticorpi diretti ad un marcatore di superficie presente solo sulle cellule di interesse mentre per selezione negativa usiamo cocktail di anticorpi mirati a marcatori di superficie presenti in tutte le cellule ma le cellule di interesse. Quest'ultima tecnica presenta il vantaggio di lasciare le cellule di interesse privi di anticorpi, riducendo così il rischio di attivazione delle cellule indesiderate o differenciation. In questo video-protocollo dimostriamo come separare le cellule NK dal sangue umano per selezione negativa, utilizzando il kit RosetteSep dalle tecnologie StemCell. La procedura comporta l'ottenimento di sangue periferico umano (con una revisione istituzionale bordo approvato il protocollo per proteggere i soggetti umani) e mescolandolo con un cocktail di anticorpi che si legano ai marcatori assenti sulle cellule NK, ma presente su tutte le altre cellule mononucleate presenti nel periferico sangue (ad esempio, i linfociti T, monociti …). Gli anticorpi presenti nel cocktail sono coniugati ad anticorpi diretti a glicoforina A eritrociti su. Tutte le cellule indesiderate e globuli rossi saranno quindi intrappolati in complessi. Il mix di cocktail di sangue e anticorpo è poi diluito, sovrapposto su una pendenza HISTOPAQUE, e centrifugati. Le cellule NK (> 80% puro) potranno essere ritirati presso l'interfaccia tra il HISTOPAQUE e il plasma diluito. Cocktail simili sono disponibili per l'arricchimento di altre popolazioni di cellule, come i linfociti T umani.

Protocol

Un protocollo dettagliato è incluso in ogni cocktail Rosetta isolamento settembre ed è disponibile online sul sito della StemCell tecnologie 1.

Discussion

Le cellule isolate con questa tecnica può essere ulteriormente suddiviso in diverse popolazioni con altri kit di separazione delle cellule.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Rosette Sep cocktail for human NK cells	Reagent	StemCell Technologies	15065
PBS, steile, 1x	Reagent	Gibco / Invitrogen	14040-058
Fetal calf serum (FCS, FBS)	Reagent	Gibco / Invitrogen	16140-071
Histopaque-1077	Reagent	Sigma	10771

PBS supplemented with 2% FCS and Histopaque solutions must be brought to room temperature before the begining of the procedure.