Enriquecimento das células NK do sangue humano com o Kit RosetteSep de StemCell Technologies
Summary
Células natural killer são uma pequena população de linfócitos. Aqui nós mostramos como isolar estas células do sangue humano por seleção negativa, usando um kit de StemCell Technologies. As células obtidas são viáveis e intocada por anticorpos e, portanto, pronto para ser usado para uma série de procedimentos.
Abstract
Natural killer (NK) são grandes granular linfócitos citotóxicos que pertencem ao sistema imune inato e desempenham um papel importante na luta contra o câncer e infecções, mas também estão implicados nos estágios iniciais da gravidez e da rejeição do transplante. Essas células estão presentes no sangue periférico, a partir do qual eles podem ser isoladas. As células podem ser isoladas por meio de seleção positiva ou negativa. Para a seleção positiva usamos anticorpos dirigidos a um marcador de superfície presente apenas nas células de interesse enquanto que para seleção negativa usamos cocktails de anticorpos direcionados para marcadores de superfície presentes em todas as células, mas as células de interesse. Esta última técnica apresenta a vantagem de deixar as células de juros livre de anticorpos, reduzindo assim o risco de ativação das células indesejáveis ou diferenciação. Neste vídeo protocolo demonstramos como separar as células NK do sangue humano por seleção negativa, usando o kit RosetteSep de StemCell tecnologias. O procedimento envolve a obtenção de sangue periférico humano (sob uma placa de revisão institucional aprovado pelo protocolo para proteger os seres humanos) e misturá-lo com um coquetel de anticorpos que se ligam a marcadores ausente em células NK, mas presente em todas as outras células mononucleares presentes na periferia sangue (por exemplo, os linfócitos T, monócitos …). Os anticorpos presentes no cocktail são conjugados a anticorpos direcionados para Glicoforina A eritrócitos por diante. Todas as células não desejadas e células vermelhas do sangue, portanto, ser preso em complexos. A mistura de cocktail de sangue e anticorpo é então diluída, sobrepostos em um gradiente Histopaque, e centrifugado. Células NK (> 80% puro) pode ser coletada na interface entre o Histopaque eo plasma diluído. Cocktails similares estão disponíveis para o enriquecimento de populações de células, tais como linfócitos T humanas.
Protocol
Discussion
As células isoladas usando esta técnica pode ser ainda separados em diferentes populações utilizando kits de separação outras células.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Rosette Sep cocktail for human NK cells | Reagent | StemCell Technologies | 15065 | |
| PBS, steile, 1x | Reagent | Gibco / Invitrogen | 14040-058 | |
| Fetal calf serum (FCS, FBS) | Reagent | Gibco / Invitrogen | 16140-071 | |
| Histopaque-1077 | Reagent | Sigma | 10771 |
