Visualisering af Mitokondriel Respiratorisk funktion ved hjælp af cytochrom C Oxidase / succinat dehydrogenase (COX / SDH) Dobbelt-mærkning Histochemistry
Summary
Cytochrom c oxidase / natrium dehydrogenase (COX / SDH) double-mærkning metode giver mulighed for direkte visualisering af mitokondrie respiratoriske enzym mangler i fersk-frosne vævssnit. Dette er en ligetil histokemiske teknik og er nyttig i at undersøge mitokondrie-sygdomme, aldring og aldersrelaterede sygdomme.
Abstract
Mitokondrie-DNA (mtDNA) mangler er en vigtig årsag til sygdom og kan ligge til grund aldring og aldersrelaterede forandringer 1,2. Den mitokondrie teori om aldring antyder en rolle for mtDNA mutationer, som kan ændre bioenergetik homeostase og cellulære funktion i aldringsprocessen 3. Et væld af beviser er blevet udarbejdet til støtte for denne teori 1,4, et eksempel er den mtDNA mutator musen 5, men den nøjagtige rolle mtDNA skade i aldring er ikke helt forstået 6,7.
Observere aktiviteten af luftvejene enzymer er en enkel metode til undersøgelse af mitokondriel dysfunktion. Kompleks IV, eller cytochrom c oxidase (COX), er afgørende for mitokondrie-funktion. Den katalytiske subunits af COX er kodet af mtDNA og er afgørende for samling af de komplekse (Figur 1). Således er ordentlig syntese og funktion i vid udstrækning baseret på mtDNA integritet 2.Selv om andre respiratoriske komplekser kunne undersøges, komplekser IV og II er de mest modtagelig for histokemiske eksamen 8,9. Complex II, eller succinat dehydrogenase (SDH), er helt kodet af nukleare DNA (figur 1), og dets aktivitet er typisk ikke påvirkes af nedsat mtDNA, selv om en stigning kunne tyde mitokondrie biogenese 10-12. Den nedskrevne mtDNA observeret i mitokondrie-sygdomme, aldring og aldersrelaterede sygdomme ofte fører til tilstedeværelsen af celler med lav eller ingen COX aktivitet 2,12-14. Selvom COX og SDH aktiviteter kan blive undersøgt individuelt, har den sekventielle dobbelt-mærkning metode 15,16 viste sig at være en fordel med at finde celler med mitokondriel dysfunktion 12,17-21.
Mange af de optimale forfatninger analysen er fastlagt, så som substrat koncentration, elektronacceptorer / donorer, mellemliggende elektron luftfartsselskaber, indflydelse af pH, og reaktionen tIME 9,22,23. 3,3 '-diaminobenzidin (DAB) er en effektiv og pålidelig elektron donor-22. I celler med fungerende COX, vil den brune indamine polymer produkt lokalisere i mitokondrie cristae og mætte celler 22. Disse celler med dysfunktionelle COX vil derfor ikke blive mættet af DAB-produkt, der giver mulighed for visualisering af SDH aktivitet ved reduktion af nitroblue tetrazolium (NBT), en elektron acceptor, at en blå formazan slutprodukt 9,24. Cytokrom c og natrium succinat substrater er tilføjet til normalisere endogene niveauer mellem kontrol og syge / mutant væv 9. Katalase er tilføjet som en sikkerhedsforanstaltning for at undgå en eventuel forurening reaktioner fra peroxidaseaktivitet 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), en mellemliggende elektron luftfartsselskab, der bruges i forbindelse med natriumazid, en respiratorisk kæde-hæmmer, for at øge dannelsen af den endelige reaktionsprodukter 9,25. På trods af dette informereation, nogle kritiske detaljer, der påvirker resultatet af denne sømmelig ligetil assay, foruden specificitet kontrol og fremskridt i teknikken, er endnu ikke blevet præsenteret.
Protocol
Discussion
Den kombinerede COX / SDH histokemiske metode gør det muligt for visualisering af celler med mitokondriel dysfunktion. Denne teknik, med tidlige undersøgelser helt tilbage til 1968, er stadig populær, og mange overvejer det "gold standard" for at identificere mitokondrielle sygdomme hos patienter, 14,19,26,27. Det er nu ofte bruges til at undersøge mtDNA-mutation-drevet aldring og aldersrelaterede sygdomme 12,13,18,20,21,24. Den COX / SDH dobbelt-mærkning metode anvendes ofte paralle…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Aging (AG04418), National Institute on Drug Abuse, National Institute of Health-Karolinska Institutet Graduate Partnerskaber Program, Karolinska Institutet, svensk Research Council, svenske Brain Power, og svenske Brain Foundation. Mange tak til Mattias Karlen og Dr. Giuseppe Coppotelli til kreativ støtte med figur 1 og 2, henholdsvis Karin Pernold for teknisk bistand og DRS. Barry J. Hoffer, Lars Olson, og Nils-Göran Larsson til meget nyttige råd og diskussion.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dry Ice | AGA Gas AB | block form | |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma-Aldrich | 277258 CAS: 78-78-4 |
|
| Cyrostat embedding solution | Sakura Finetek | Tissue Tek 4583 | |
| Cryostat | Microm | Microm Model HM 500M | |
| Slides | Thermo Scientific | Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ |
|
| Cover glasses Borosilicate glass |
VWR International | 16004-098 | 24 x 50 mm |
| Filter Paper | Munktell Filter AB | Quality: 1350 Article Number: 242 001 |
430 x 430 mm |
| 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Sigma-Aldrich | Sigma Liquid Substrate System, D7304 | |
| Cytochrome c (Type III, from equine heart) | Sigma-Aldrich | C2506 CAS: 9007-43-6 |
|
| Bovine catalase (from liver) | Sigma-Aldrich | C9322 CAS: 9001-05-2 |
|
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 CAS: 298-83-9 |
|
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 CAS: 6106-21-4 |
|
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 CAS: 299-11-6 |
PMS is light sensitive. Shield from light. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 CAS: 26628-22-8 |
|
| Xylene | VWR International | EM-XX0060-4 | |
| Entellan | VWR International | 100503-870 | |
| Malonate (Malonic acid) |
Sigma-Aldrich | M1296 CAS: 141-82-2 |
References
- Larsson, N. G. Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging. Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).
- Cottrell, D. A. Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).
- Harman, D. The biologic clock: the mitochondria. J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).
- Wallace, D. C. Mitochondrial genetics – a paradigm for aging and degenerative diseases. Science. 256, 628-632 (1992).
- Trifunovic, A. Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase. Nature. 429, 417-423 (2004).
- Ameur, A. Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins. PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).
- Safdar, A. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).
- DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C. Mitochondrial myopathies. Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985).
- Old, S. L., Johnson, M. A. Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle. Histochem. J. 21, 545-555 (1989).
- Chaturvedi, R. K. Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington’s disease. Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).
- Edgar, D. Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice. Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).
- Ross, J. M. High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).
- Crugnola, V. Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis. Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).
- Nonaka, I. Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency. Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).
- DiMauro, S. Mitochondrial encephalomyopathies. Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990).
- Bonilla, E. New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies. Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).
- Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle. Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).
- Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death. Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).
- Gellerich, F. N. Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size. Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).
- Larsson, N. G. Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice. Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).
- Ekstrand, M. I. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).
- Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB). J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).
- Dubowitz, V., Brooke, M. Muscle Biopsy: A Modern Approach. , (1973).
- Cottrell, D. A. Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age. Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).
- Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres. Histochem. J. 20, 230-243 (1988).
- Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle. Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).
- Petruzzella, V. Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243. Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).
- Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations. J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).
- Haas, R. H. The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease. Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).
